在冠狀動脈疾病中，早期的缺血再灌注以及經皮冠狀動脈介入治療可以在一定程度上降低心肌梗死，但也會增加心肌缺血再灌注損傷（IRI）的風險。而缺血后灌注不僅可以減少IRI，也在一定程度上下調了心肌細胞凋亡。外泌體包裹的miRNA在心血管系統內的細胞間通訊有重要作用，心肌成纖維細胞（CFs）是心臟中數量最多的細胞，其是否通過分泌的外泌體中的miRNA在缺血后處理中起到對心肌的保護作用還有待研究。中南大學的羅慧博士通過建立transwell共培養系統，缺氧/復氧（H/R）可以促進CFs外泌體的產生，缺血后處理可以增強CFs外泌體對H/R細胞的保護功能。

技術路線

結果

1.心臟成纖維細胞分泌的外泌體保護H/R后H9C2細胞活性，且H/R-后處理可以增強這種保護作用。與常氧組相比，H/R后 H9C2細胞活性降低，H9C2細胞與成纖維細胞共培養時，細胞活性增加（圖A）；WB檢測細胞凋亡，H/R后，細胞凋亡增多，H/R后處理，細胞凋亡下降（圖B）；GW-4869處理CFs,CFs中CD63陽性囊泡積累大于對照組和DMSO處理組（圖C）；GW-4869可以明顯降低CFs的活性（圖D）；GW-4869處理后，細胞凋亡升高（圖E）；HR-后處理可以增強CFs分泌外泌體對心肌的保護作用（圖F，圖G）

2.H/R和H/R后處理，從CFs細胞釋放的外泌體可被H9C2細胞攝取。電鏡鑒定外泌體（A）;NAT鑒定外泌體（B）;WB鑒定外泌體標志蛋白檢測（C）;H/R和H/R后處理增強CFs外泌體標志蛋白的增加，H/R后處理可以進一步促進CFs分泌外泌體（D、E、F）；CFs分泌的外泌體（PKH26標記）可被H9C2細胞攝取（H,I）

3.H/R后CFs分泌的外泌體對心肌細胞具有保護作用。將H9C2細胞用PBS、H/R CFs分泌的外泌體、H/R后處理CFs分泌的外泌體處理，再進行H/R處理。H/R后處理CFs分泌的外泌體明顯提高細胞生存率，降低細胞凋亡，其對心肌細胞的保護能力大于H/R CFs分泌的外泌體,H/R后處理可以增強體外循環中CFs外泌體對細胞的保護作用（A,B）;心肌梗死面積檢測I/R后外泌體處理可以明顯減少心肌梗死面積（C、D）；Tunel染色檢測細胞凋亡（E、F）;I/R處理后，心肌膠原組織顯著沉積，CFs外泌體可以明顯減少膠原沉積（G）。

4.H/R-CFs-exo和H/R-后處理-CFs-exo  miRNA表達譜。miRNA測序，11個差異miRNA（A）;PCR驗證差異miRNA;PCR驗證CFs中miR-423-3p表達（B）；PCR檢測CFs外泌體中miR-423-3P表達（C）；在心肌梗死區，miR-423-3p明顯下調，且I/R-后處理逆轉了這一效應（D）; I/R-后處理增加梗死邊緣區miR-423-3p表達（E）; miR-423-3p表達在梗死區迎合梗死邊緣區表達差異（F）; miR-423-3p在各組中的含量變化（G）； miR-423-3p過表達后檢測各組miR-423-3p變化，以及各組細胞活性（H,I）;WB檢測miR-423-3p過表達后細胞凋亡變化（J）。

5.下調miR-423-3P過表達可降低I/R后對心肌的保護作用。TTC染色檢測心肌梗死面積，下調miR-423-3P過表達可以增加心梗面積（A,B）;TUNEL染色檢測細胞凋亡（C）。

6.miR-423-3P通過靶向Rap2c保護H9C2細胞面授H/R損傷。H/R可以下調miR-423-3P的表達（A）;CCK-8檢測細胞活性（B）; miR-423-3P對細胞凋亡的影響（C）;PCR驗證miR-423-3P與靶基因Rap2c的關系（D）;雙熒光素酶報告基因實驗確定miR-423-3P與靶細胞Rap2c的關系（E）；PCR，WB檢測 Rap2c在H/R后的表達變化（F,G）;SiRap2c檢測細胞凋亡。