2018年度諾貝爾生理或醫(yī)學(xué)獎頒給了美國科學(xué)家詹姆斯·艾利森(James P。 Allison)和日本科學(xué)家本庶佑(Tasuku Honjo)。兩位科學(xué)家因發(fā)現(xiàn)“抑制負(fù)免疫調(diào)節(jié)的癌癥療法”獲此殊榮。

作為全球抗腫瘤藥物市場最閃耀的明星，以PD-1、CAR-T為代表的免疫療法近幾年風(fēng)靡全球，國內(nèi)研發(fā)熱情空前。此次諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎頒給了免疫療法先驅(qū)，相關(guān)研究也有望在明年基金申請上變得更加受寵。

如何將腫瘤免疫治療與當(dāng)下其他熱門的研究關(guān)聯(lián)起來？

首先看下今年中標(biāo)基金PD-1研究情況：

1. PD-1/PDL-1與非編碼RNA:

2. PD-1/PDL-1與自噬:

接下來介紹一篇miRNA調(diào)控腫瘤免疫微環(huán)境的文章：

“microRNA 125a Regulates MHC-I Expression on Esophageal Adenocarcinoma Cells, Associated With Suppression of Antitumor Immune Response and Poor Outcomes of Patients”18年9月份發(fā)表在Gastroenterology（IF:20）上。

該研究發(fā)現(xiàn)，在食管癌細(xì)胞系和腫瘤組織中， MIR125a-5p和MIR148a-3p水平增加可降低抗原呈遞所需的TAP2和MHC-I的水平。食管癌高表達(dá)的MHC-I分子與適應(yīng)性免疫應(yīng)答的標(biāo)記物相關(guān)，且顯著縮短患者的總體生存時間。

該文章機制簡單：miRNA-靶向MHC-I通路上的TAP2。

樣本：兩株細(xì)胞系，51個食管癌病人包埋癌組織，及病人信息。

研究手段只涉及一些常規(guī)實驗：RNA-seq,  qPCR,  wb, 熒光素酶報告基因?qū)嶒灒魇剑?xì)胞毒性實驗。生信分析：基因集富集分析；統(tǒng)計學(xué)：Cox回歸分析通路與OS和RFS的關(guān)系， KM生存分析。

主要研究方案：

1. 尋找差異表達(dá)MHC-I 通路的食管癌細(xì)胞系

為確定食管癌中MHC-I基因表達(dá)的潛在調(diào)控機制，首先使用兩個食管癌細(xì)胞系:OE33和OE19。之前PCR證明 OE33和OE19細(xì)胞在參與抗原呈遞機制的TAP1和TAP2表達(dá)上存在差異。

這里作者進一步驗證TAP1、TAP2和HLA-B 的RNA和蛋白質(zhì)水平在OE19中較OE33中低表達(dá)(圖1 A-C)。

MHC通路激動劑IFNG處理OE19細(xì)胞后，這幾個基因表達(dá)增加（(圖1D）。使用細(xì)胞芯片證實該通路在OE19細(xì)胞中下調(diào)（圖1E）。

2. 篩選OE33和OE19細(xì)胞中差異miRNA

qPCR芯片檢測88個調(diào)控免疫的miRNA在這兩株細(xì)胞中的表達(dá)（圖2A）

對OE19細(xì)胞中上調(diào)的7個miRNA進行單個PCR，都獲得驗證（圖2B）。

而結(jié)合位點預(yù)測只發(fā)現(xiàn)MIR125a-5p和MIR148a-3p靶向MHC-I通路中的基因（圖2C），其中MIR148a-3p已被報道。

熒光素酶報告基因?qū)嶒炦M一步驗證MIR125a-5p靶向TAP2（圖2D、E）

3. 驗證MIR125a-5p和MIR148a-3p對靶基因的調(diào)控，導(dǎo)致免疫逃逸

MIR125a-5p mimics 轉(zhuǎn)染OE33細(xì)胞，qPCR和WB驗證 靶基因TAP2表達(dá)下調(diào)（圖3A、B）

流式細(xì)胞術(shù)顯示，轉(zhuǎn)染MIR125a-5p或MIR148a-3p后，MHC-I細(xì)胞表面表達(dá)下降(圖3C)

驗證MHC通路激動劑IFNG對這兩個miRNA的調(diào)控：IFNG處理后，MHC-I缺陷的OE19細(xì)胞中兩種miRNA水平顯著降低(圖3D)。解釋了圖1中，IFNG處理后TAP2等上調(diào)情況。

接下來，作者研究由MIR125a-5p和MIR148a-3p誘導(dǎo)的TAP2和MHC-I表達(dá)降低是否對特異性CTL識別和殺傷腫瘤細(xì)胞有功能影響。MIR125a-5預(yù)轉(zhuǎn)染降低T細(xì)胞誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性(圖3E)

食管癌組織MIR125a-5p原位雜交和TAP2免疫組化驗證表達(dá)及兩者相關(guān)性（圖4）

4. MHC-I通路表達(dá)與抗腫瘤免疫應(yīng)答及腫瘤復(fù)發(fā)的關(guān)系

作者使用一個整合基因表達(dá)(51個病人RNA-seq)、生存數(shù)據(jù)和通路的疾病分型管道（圖5A）。

發(fā)現(xiàn)能夠反映MHC-I介導(dǎo)的抗原呈遞 的通路位于前3個的免疫相關(guān)通路，且能將患者分為兩組，生存率顯著差異（圖5B）。

KM生存率分析顯示，抗原呈遞途徑的高表達(dá)與新輔助放化療后手術(shù)切除患者的不良RFS和OS相關(guān)（圖5C、D）。

將低表達(dá)和高表達(dá)上述基因的患者進行KM生存率分析，結(jié)果顯示，TAP1高表達(dá)與不良OS相關(guān)，而TAP1、TAP2和HLA-A與不良RFS相關(guān)（圖5E、F）;

利用基因集富集分析“抗原呈遞”途徑的表達(dá)，定義MHC-I“低”和“高”患者亞群 （5G），MHC-Ihigh亞群，與臨床反應(yīng)抗PD-1 相關(guān)（圖5H）, 而高表達(dá)PD-L1, PD-L2, and IDO1與不良RFS相關(guān)（圖5I-K）,高表達(dá)PD-L1與不良OS相關(guān)（圖L）

5. 食管癌中腫瘤免疫微環(huán)境的IHC鑒定

最近的研究表明，結(jié)合基因表達(dá)譜和免疫組化在預(yù)處理活檢中提高了預(yù)測免疫治療反應(yīng)的準(zhǔn)確性。為在蛋白水平上分析所用食管癌樣本的腫瘤免疫微環(huán)境，作者對石蠟包埋組織進行了CD8A、PD-1、PD-L1和PD-L2的IHC分析。與RNA-seq分析結(jié)果一致，與未復(fù)發(fā)的患者相比，復(fù)發(fā)且MHC-I表達(dá)較高的患者腫瘤中CD8A、PD-1、PD-L1、PD-L2陽性細(xì)胞增多。