肝細胞癌（HCC）是原發性肝癌最常見的病理類型之一，危害大，有多種誘因，肥胖亦被視為導致肝細胞癌的重要危險因素之一，但目前針對肥胖與肝細胞癌之間關系的研究還十分的少。今年4月，Dr. Haiyang Zhang等人在雜志《Oncogene》上發表了一篇題為“Exosome circRNA secreted from adipocytes promotes the growth of hepatocellular carcinoma by targeting deubiquitination-related USP7”的文章，研究者們認為脂肪細胞可以通過分泌外泌體吸收miR-34a并激活USP7/Cyclin A2通路，最終促進肝細胞癌的發生發展，并通過一系列的實驗證實了自己的猜想。

摘要：

肝細胞性肝癌（HCC）是肝癌的主要表現形式，其發病率不斷上升，且預后較差。脂肪組織能量儲存和通過分泌脂肪因子調節代謝的功能已被熟知。環狀RNA（circRNA）是一種新型的非編碼RNA，近年來被認為是腫瘤發生發展過程中的關進因子，但從脂肪組織中提取的外泌體circRNA的作用尚不明確。在這里，脂肪分泌的circRNA被發現可在HCC中調控去泛素化，從而促進細胞生長。研究發現，在體脂較高的HCC患者中，外泌體環狀-去泛素化(circ-DB)表達上調。此外，體外和體內的研究表明exocirc-DB通過抑制miR-34a和激活去泛素化相關USP7促進HCC生長并減少DNA損傷。最終，結果表明，脂肪外泌體對HCC細胞的作用可以通過敲除circ-DB逆轉。這些結果顯示脂肪細胞分泌的外泌體cirRNAs通過抑制miR-34a和激活USP7/Cyclin A2信號通路促進腫瘤生長并減少DNA損傷慢性乙型肝炎(HBV)或丙型肝炎(HCV)感染、過度飲酒、免疫相關肝炎和肥胖通常被認為是導致HCC的主要危險因素。在肝癌細胞中,miR-34a在β-catenin監管中起著至關重要的作用。然而，miR-34a與circRNA之間的相互作用仍然未知。泛素特異性蛋白酶7 (USP7)是一種去泛素化酶，在細胞周期、增殖、DNA修復等多種細胞過程中發揮重要作用。高水平的USP7常出現在HCC組織中，這與腫瘤的生長和侵襲有關，導致總體生存率較低。USP7抑制劑P5091誘導慢性淋巴細胞白血病(CLL)生長停滯和凋亡。在肝細胞腫瘤發生過程中，泛素特異性蛋白酶驅動細胞周期的發展。 近年來的研究表明，Cyclin A2是USP7的重要下游底物，活躍的USP7/Cyclin A2信號通路可以促進乳腺癌的生長。
一、HCC中exo-circ-DB和USP7的表達模式

  從HCC患者和正常受試者(NC)的血漿中分離出外泌體。利用western blot尋找外泌體特異性標志物，將患者分組，檢測USP7表達水平，采用RT-qPCR檢測外泌體中circ-DB的表達水平，并結合WB和灰色分析對USP7蛋白進行定量。數據表明，體脂比較高的HCC患者外泌體circ-DB上調，且circ-DB與USP7表達呈正相關。

Fig. 1 HCC中exo-circ-DB和USP7的相關性研究。 a 從人血漿中分離的外泌體透射電鏡（TEM）圖像(比例尺，100 nm)。 b 從正常受試者(NC)和HCC患者中分離血漿外泌體。三種代表性外泌體特異性標志物的Western blotting結果：CD63, Alix和Tsg101。 c 用NAT分析檢測血漿外泌體的大小范圍。 d 根據HCC患者體脂比例中位數，將HCC患者分為中位以上組(n = 21)和中位以下組(n = 19)。 e 使用安捷倫芯片微陣列掃描儀初步篩選HCC的circ-RNA (n = 21 ，n = 19)。 f, g 中位數以上組和中位數以下組USP7的WB分析(n = 21, n = 19)。 h circ-DB與USP7之間潛在相互作用的代表性圖像。 i 預測miR-34a在USP7 mRNA中的結合區域。 j 血漿exo-circ-DB與USP7蛋白的臨床相關性(n = 21)。 **p < 0.01
二、exo-circ-DB、miR-34a和USP7的臨床相關性

 通過免疫組化法(IHC)檢測癌旁組織(P)和腫瘤組織(T)中USP7的表達，利用PT-PCR檢測各組circ-DB表達量，檢測各組中miR-34a和USP7的表達。數據表明，血漿外泌體circ-DB在中位以上組上調，與miR-34a和USP7在HCC中的表達密切相關。

Fig. 2 HCC中exo-circ-DB、miR-34a和USP7的臨床相關性. a 應用免疫組織化學染色法(IHC)檢測癌旁組織(P)和腫瘤組織(T)中USP7的表達。比例尺，100 μm。 b 根據USP7 mRNA的平均值將HCC患者分為兩組。USP7的表達與HCC的生存密切相關（高組中n = 1595，低組中n = 2356）。 c–e 中位以上組和中位以下組中exo-circ-DB、腫瘤組織中miR34a和腫瘤組織中USP7的水平（n = 21，n = 19）。f, g exo-circ-DB與miR-34a呈負相關(n = 21, R = 0.735)，miR-34a與USP7呈負相關(n = 21, R = 0.762)。 **p < 0.01
三、miR-34a與USP7的直接相互作用

  miR-34a被認為是與細胞周期、細胞增殖和生存相關的癌癥相關基因的調控因子。USP7是預測出的高可信靶點之一。研究者使用miRNA模擬物被用來過表達miR-34a, 使用miRNA抑制劑來抑制miR-34a的表達。使用生物素標記的miR-34a進行免疫沉淀，以確定miR-34a是否直接與USP7相互作用。通過熒光素酶報告實驗進一步證明miR-34a對 USP7的調控作用。結果表明miR-34a直接抑制USP7, Cyclin A2是USP7的重要下游底物。

Fig. 3 驗證USP7在HCC細胞中作為miR-34a的直接靶點以及Cyclin A2的靶點。a miR-34a和USP7可能的結合位點。 b miR-34a水平的RT-PCR分析（n = 3）。 c 被biotin-miR-34a捕獲的USP7 mRNA的RT-qPCR分析 (n = 3)。d miR-34a直接識別USP7（n = 3）。含有野生型(WT)或突變型(Mut) USP7的螢火蟲熒光素酶報告基因，將miR-34a模擬物和相關正常對照物共轉染293個T細胞。轉染后檢測相對熒光素酶水平(n = 3)。 e–g WB顯示了miR-34a模擬物或miR-34a抑制劑治療的HCC細胞中USP7和cyclin A2的表達水平(n = 3)。 h RT-PCR定量檢測相應的USP7和cyclin A2表達(n = 3)。i, j 當USP7過表達或被siRNA抑制時，Cyclin A2的表達水平(n = 3)。 **p < 0.01
四、脂肪細胞外泌體對肝癌細胞miR-34a、USP7和Cyclin A2的影響

  研究者利用透射電鏡觀察3T3L1細胞外泌體的形態，檢測3T3L1細胞中CD63、Alix和tsg10的表達量。用成熟脂肪細胞分泌的外泌體處理HCC細胞，檢測miR-34a、USP7和cyclin A2水平。將circ-DB的siRNA轉染到3T3L1細胞中以去除外泌體中的circ-DB，轉染48小時后收集外泌體。由結果可知，脂肪細胞外泌體作為exo-circ-DB的載體，上調USP7和cyclin A2。

Fig. 4 miR-34a、USP7和Cyclin A2的表達受脂肪細胞外泌體調控。 a 3T3L1外泌體的透射電鏡圖像(比例尺，100 nm)。b WB檢測CD63、Alix、Tsg101表達。c 成熟脂肪細胞和脂肪前體細胞的油紅O染色。d, e circ-DB在成熟和前體脂肪細胞(d)以及3T3L1細胞外泌體(e)中的表達差異(n = 3)。f 成熟脂肪細胞外泌體治療HCC細胞的圖示。 g–i miR-34a在成熟脂肪細胞外泌體治療的HCC細胞中的定量表達以及USP7和cyclin A2的表達水平 (n = 3)。**p < 0.01

五、circ-DB與miR-34a的相關性

  通過熒光素酶報告基因實驗進一步揭示了circ-DB與miR-34a的直接聯系，構建含有mir-34a結合區1或2的熒光素酶報告質粒，每個質粒包含一個mir-34a結合區域。將含有mir-34a結合位點（mut）逆序序列的質粒作為陰性對照。然后使用WB檢測USP7和Cyclin A2的表達水平以進一步評價circ-DB對USP7或Cyclin A2的影響。

Fig. 5 circ-DB調控miR-34a/USP7/Cyclin A2通路。a, b miR-34a在circ-DB中的兩個預測結合區域。c, d 通過熒光素酶實驗驗證miR-34a與circ-DB之間的相互作用(n = 3)。e circ-DB的RT-PCR定量或circ-DB siRNA的抑制作用。f 細胞經circ-DB-OE質粒和circDB siRNA處理后的miR-34a水平。g, h 用circ-DB-OE質粒和circDB處理的成熟脂肪細胞中USP7和Cyclin A2的表達水平(n = 3)。i 用circ-DB-OE質粒和circ-DB siRNA (f)處理的3T3L1細胞中USP7的定量(n = 3) **p < 0.01，***p < 0.001

六、 脂肪exo-circ-DB促進肝癌細胞的生長，抑制DNA損傷

研究者檢測了脂肪來源的外泌體對肝癌細胞生物學行為的影響。隨后，將circ-DB過表達質粒和circ-DB siRNA轉染HepG2細胞，進一步揭示circ-DB在HCC中的生物學作用。由結果可知脂肪外泌體通過傳遞circ-DB促進肝癌細胞的增殖和遷移，減少DNA損傷。

Fig. 6 外泌體circ-DB促進腫瘤生長，減少DNA損傷。用3T3 exo或circDB被circ-DB siRNA去除的3T3 exo預處理HCC細胞。a, b 用Edu實驗檢測細胞增殖(n = 3)。c, d用transwell法測定細胞遷移(n = 3)。e, f DNA損傷評估(n = 3)。**p < 0.01

Fig. 7 circ-DB和USP7在肝癌細胞增殖和DNA損傷調控中的作用。用circ-DB過表達質粒（OE.circ-DB）預處理HCC細胞，用circDB siRNA（si.circ-DB）去除circ-DB siRNA。a, b 用DAPI和EdU對細胞進行染色，核成像顯示肝癌細胞的增殖(n = 3)。c, d 用DAPI和H2AFX進行細胞染色，然后核成像(n = 3)。用USP7過表達質粒（OE.USP7）和USP7 siRNA （si.USP7）預處理HCC細胞。e, f 用DAPI和EdU對細胞進行染色，然后核成像顯示HCC細胞的增殖情況(n = 3)。g, h 用DAPI和H2AFX染色細胞，然后核成像 (n = 3)。**p < 0.01

七、USP7介導HCC中cyclin A2去泛素化

  Cyclin A2是Cyclin家族成員之一，在S期促進DNA合成，促進細胞周期從G2期向M期過渡。Cyclin A2功能障礙與細胞錯誤增殖和染色體不穩定有關。

研究者通過結合cyclin A2免疫沉淀和UB WB，研究USP7在介導cyclin A2去泛素化過程中的作用；加載HCC細胞總蛋白來檢測cyclin A2的表達，利用cyclin A2抗體拉低的免疫沉淀分析cyclin A2的泛素化。

總結得到的結果，可知USP7通過降低包括cyclin A2在內的多種蛋白的泛素化而發揮致癌基因的作用。

Fig. 8 Exo-circ-DB和USP7調控cyclin A2的去泛素化。按上述方法處理HCC細胞，免疫沉淀法分析其泛素化水平。a 3T3外泌體處理的HCC細胞中Cyclin A2泛素化的WB分析（n = 3）。 b 用USP7質粒或USP7 siRNA處理的肝癌細胞中Cyclin A2泛素化的WB分析（n = 3）。c circ-DB質粒或circ-DB siRNA處理的HCC細胞中Cyclin A2泛素化的WB分析（n = 3）。d miR-34a模擬物或miR-34a抑制劑處理的HCC細胞中Cyclin A2泛素化的WB分析（n = 3）。**p < 0.01
八、    circ-DB在體內增強腫瘤生長，提高體脂比

  將腫瘤植入小鼠，觀察脂肪細胞分泌的外泌體circRNA對體內腫瘤生長的影響。用慢病毒轉染小鼠肝細胞癌細胞(Hepa1-6細胞)，轉染序列為circDB過表達(circ-DB-OE)或circ-DB shRNA (circ-DB-KD)。C57小鼠和ob/ob小鼠皮下植入肝細胞腫瘤細胞，PBS作為陰性對照。第28天處死小鼠，并對數據進行分析。

  分析數據可知脂肪來源的外泌體可以在體內將circ-DB導入HCC腫瘤，脂肪分泌的circ-DB促進了腫瘤的生長和轉移。

Fig. 9 a 外泌體circ-DB對小鼠肝癌模型的影響。按原理圖描述的實驗設計構建動物模型。 b 從小鼠血漿中分離的外泌體TEM照片。c 外泌體標記物的WB分析。d 未經處理的C57和ob/ob小鼠的血清外泌體中circ-DB的定量(n = 6)。e f C57小鼠(e)或ob/ob小鼠(f)血清外泌體中circ-DB的相對水平(n = 6)。g 腫瘤組織中circ-DB的相對水平(n = 6)。h 6組腫瘤照片(n = 6)。i–l 各組的腫瘤重量、小鼠體重、體脂比、肝轉移數(n = 6)。 **p < 0.01

九、    circ-DB/miR-34a/USP7軸在小鼠腫瘤組織中的表達模式

  這些數據進一步說明circ-DB在HCC腫瘤中作為miR-34a海綿發揮作用，miR-34a下調激活USP7/cyclin A2，導致腫瘤生長和轉移增強。

結果：

  綜上所述，本研究證實脂肪細胞分泌的外泌體circRNA通過吸收miR-34a并激活USP7/Cyclin A2通路，在促進HCC腫瘤生長方面發揮重要作用。這些發現為理解脂肪組織和肝細胞癌之間的關系提供了深入的見解。