2019年7月4日，來自北京大學醫學部天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室的研究團隊在雜志small（IF=10.856）上報道了內源性外泌體能轉運有功能的gRNA和Cas9蛋白（doi: 10.1002/smll.201902686）(Chen, Huang et al. 2019)。讓我們一起來了解一下。

外泌體是廣泛存在于各種體液中的由細胞分泌的納米級囊泡，并攜帶有蛋白質、脂質和各類型核酸。它在許多生物過程中都發揮著重要作用。一些外泌體中的miRNA、lncRNA等已被鑒定為腫瘤的診斷、預后標志物或治療靶標。在另一方面，它也被作為一種藥物轉運載體被廣泛研究。除了對傳統藥物的包裝之外，對核酸以及CRISPR-Cas9相關的基因編輯治療藥物的包裝也是研究熱點。例如在Gulei D的報道中，通過在外泌體供體細胞中表達TNF-α獲得表面有TNF-α蛋白的外泌體，然后在將CRISPR-Cas9系統轉入外泌體中特異性的識別腫瘤細胞（圖1）(Gulei and Berindan-Neagoe 2019)。

                                         圖1 制備含TNF-α的外泌體轉運CRISPR系統

而本文中，作者首先提出問題：外泌體是否能直接轉運細胞內的CRISPR-Cas9系統至其他細胞。作者以HBV穩定復制的細胞HepAD38為模型，共轉染針對HBV的Cas9蛋白和一對sgRNA后，HBV的復制受到30%的抑制。而使用特異性抑制外泌體釋放的抑制劑GW4869處理后，CRISPR系統對HBV的抑制效果顯著降低。這預示著外泌體在這個過程中發揮著作用。作者便開始驗證外泌體中是否含有Cas9蛋白和gRNA。通過離心和CD63 pull-down的方法提取外泌體后，通過western blot和PCR分別檢測到了外泌體中Cas9蛋白和gRNA的存在。這表明內源性外泌體能轉運CRISPR-Cas9系統（圖2）。此外，作者也通過tCLN和TRIF的方法驗證了外泌體中gRNA的存在。此外通過對載體片段和未逆轉錄樣品的PCR檢測，也證明了外泌體中轉運的是gRNA而不是過表達載體。

                                          圖2 CRISPR過表達細胞外泌體中含有Cas9蛋白和gRNA

接下來，作者探究了外泌體轉運CRISPR-Cas9系統的機制。Cas9蛋白結合gRNA后發揮作用。那外泌體轉運Cas9蛋白和gRNA是否需要兩者結合呢？作者首先通過免疫熒光檢測到了CD63和Cas9蛋白的共定位。通過共轉和單轉Cas9和gRNA，作者發現單轉Cas9或gRNA后，兩者都能被外泌體轉運。這表明兩者被外泌體的轉運并無相互依賴的關系（圖3）。

                                          圖3 Cas9蛋白和gRNA的轉運無依賴關系

那么，外泌體轉運的CRISPR系統是否具有生物活性呢？作者將只表達針對HBV gRNA和Cas9的供體HuH 7細胞和只表達HBV的受體HuH 7細胞共培養；并以只表達Cas9的供體細胞為對照。PCR檢測結果發現，受體細胞中含有被編輯的HBV DNA片段。如圖4所示。此外，為了進一步驗證轉運CRISPR系統外泌體的生物學功能，作者從常見得生物工程細胞株Vero和CHO細胞中提取了含Cas9和gRNA的外泌體。該外泌體能作用于HuH 7細胞。共培養后也與上述結果一致，可以編輯受體細胞。

                                       圖4 外泌體中轉運的CRISPR系統具有生物學活性

這一發現即對外泌體藥物轉運研究提供助力，也對那些未發現的CRISPR/Cas系統脫靶效應和安全性做出警示。最后給出文章的模式圖（圖5）。

                                     圖5 外泌體轉運CRISPR系統并作用于受體細胞模式圖
Chen, R., H. Huang, et al. (2019). "Friend or Foe? Evidence Indicates Endogenous Exosomes Can Deliver Functional gRNA and Cas9 Protein." Small: e1902686.
Gulei, D. and I. Berindan-Neagoe (2019). "Activation of Necroptosis by Engineered Self Tumor-Derived Exosomes Loaded with CRISPR/Cas9." Mol Ther Nucleic Acids 17: 448-451.