參考文獻：
Baumgarten Sebastian., Bryant Jessica M., Sinha Ameya., Reyser Thibaud., Preiser Peter R., Dedon Peter C., Scherf Artur., (2019). Transcriptome-wide dynamics of extensive mA mRNA methylation during Plasmodium falciparum blood-stage development. Nat Microbiol, 08. IF：14.3
導語：
瘧疾奪去了許多人的生病，它的發病機理是由于惡性瘧原蟲在人體紅細胞內的無性繁殖造成的，這個過程發生在瘧疾蟲短暫的48小時生命中，并需要精確的基因表達級聯才能完成。雖然目前已經在轉錄后水平觀察到這種反應，但是在轉錄組范圍的介導機制并不清楚。因此作者在惡性瘧原蟲轉錄組中鑒定了mRNA修飾，并在血液階段發育過程中對N6-甲基腺苷（m6A）進行了全面表征。該研究展示了瘧疾寄生蟲中廣泛的m6A mRNA甲基化程序的獨特特征，并揭示其在動態微調單細胞真核生物的轉錄級聯中的關鍵作用。
結果分析：
1、鑒定惡性瘧原蟲在blood-stage階段的動態m6A甲基化程序
圖示惡性瘧原蟲在人紅細胞內的無性繁殖周期，包括紅細胞侵入、宿主細胞重構、分裂復制和紅細胞排出（圖1a）。在分析紅細胞內的發展周期（IDC）中鑒定出10個在mRNA的修飾（圖1b，c，d）。雖然m6A甲基化的程度總體都很高，但是在瘧原蟲中更高（圖1e）。
惡性瘧原蟲基因組編碼m6A mRNA甲基轉移酶的高度保守（圖2a），這個保守去編碼的蛋白命名為PfMT-A70，構建了包含HA標簽的PfMT-A70蛋白表達細胞系（圖1b）。對PfMT-A70-HA進行免疫沉淀，然后進行LC-MS，鑒定出16種特異性蛋白（圖2c，d）。三種惡性瘧原蟲的轉錄水平都在12和24h.p.i時達到高峰，比m6A/A比率最高時早一點（圖1e，2e）。

                                           圖1惡性瘧原蟲紅細胞內部（IDC）發mRNA修飾全局動態

                                            圖2 惡性瘧原蟲m6A書寫復合體的特征
2、PfMT-A70的CRISPR干擾降低了整體m6A mRNA甲基化
對于PfMT-A70的CRISPRi，我們將其啟動子定位于轉錄起始位點下游和翻譯起始位點上游~100bp，gRNA與非模板鏈互補，非特異性的gRNA表達細胞系作為陰性對照（圖3a）。gPfMT-A70靶向dCas9染色質免疫沉淀，然后測序（ChIPseq）在靶點顯示出強大且高度特異性的富集，其與富含H3K9ac5和H2A.Z33的核小體缺失區域（FAIRE）重疊（即標志惡性瘧原蟲啟動子區域；圖3b，c）。RT-qPCR表明整個IDC中PfMT-A70轉錄水平顯著下調，在12h.p.i時敲低水平為~15％，在24和36h.p.i時達到40％ （圖3d，頂部）。 雖然PfMT-A70 CRISPRi對寄生蟲生長沒有明顯的影響，但LC-MS / MS顯示在所有三個時間點m6A / A整體水平顯著下降10-30％（圖3d， 底部），進一步確定PfMT-A70是惡性瘧原蟲m6A書寫復合體的組成部分。

                                                圖3通過CRISPRi敲低PfMT-A70 m6A甲基轉移酶
3、在IDC期間，mRNA轉錄物差異地m6A-甲基化
作者使用m6A-甲基化mRNA免疫沉淀（IP）和m6A-seq測定了IDC的轉錄物特異性水平上m6A mRNA甲基化的動態。 m6A-IP及LC-MS / MS顯示抗體特異性高（圖4a）。與后生動物和植物中m6A位點的拓撲結構相反，惡性瘧原蟲中的m6A峰不會在終止密碼子和3'UTR附近富集，而表現出向5'末端定位的趨勢（圖4b，c）。作者搜索了與m6A峰相關的序列，發現GGACA基序最顯著富集，該基序類似于在酵母和人m6A位點處鑒定的RGAC和DRACH（D = G / A / U，R = G / A，H = C / A / U）基序（圖4d）。GAC基序集中在m6A峰頂周圍的±20nt區域（圖4e），表明特定m6A甲基化的某些背景依賴性。
在整個IDC中，具有至少一個m6A峰的轉錄基因總數略有增加（圖4f）。 然而，m6A富集（即m6A-IP / m6A-輸入），或來自含有特定m6A峰的一個基因的轉錄物的部分，在整個IDC中發生了廣泛的變化（圖4g）。 大多數m6A峰僅在一個時間點達到最大m6A富集，表明轉錄特異性甲基化確實是一種主動調節機制。

                                               圖4 惡性瘧原蟲IDC期間的差異m6A甲基化

4、m6A與mRNA穩定性和翻譯效率成反比關系
為了確定m6A對個體轉錄本的影響，首先比較gControl和gPfMT-A70寄生蟲之間各個m6A峰的m6A富集，并發現gPfMT-A70細胞系中所有時間點的富集都顯著減少（圖5a，b，頂部）。通過LC-MS / MS測量的gPfMTA70寄生蟲中全局m6A / A水平的降低來反映。（圖3d，底部）。 gControl和gPfMT-A70在每個時間點顯示高度相關性（圖5b，底部）。

                                             圖5 PfMT-A70基因敲除導致m6A甲基化轉錄本的上調

m6A-甲基化轉錄物具有比非甲基化轉錄物顯著更低的mRNA穩定性（圖6a，左）。 這些差異在12和24h.p.i顯著，但在36h.p.i時不顯著。在12和24h.p.i時，‘m6A敏感’轉錄物的mRNA穩定性甚至更低（m6A富集減少兩倍，轉錄本豐度增加（圖6a，右）。比較整個IDC中m6A-甲基化和非甲基化轉錄物之間的翻譯效率（TE）。在每個發育階段，m6A甲基化與轉錄物的翻譯效率顯著降低相關（圖6b，左）。這種相關性在12和24h.p.i時最為明顯，但在36h.p.i時仍然顯著。 與mRNA穩定性所見的模式類似，在12和24h.p.i時m6A甲基化和‘m6A敏感’轉錄物子集之間的翻譯效率的顯著降低（圖6b，右）。

5、惡性瘧原蟲編碼進化上保守的，多樣化的m6A結合蛋白
惡性瘧原蟲基因組編碼含有YTH結構域的兩種不同蛋白質：PfYTH.1（PF3D7_1419900，此前注釋為‘切割和多聚腺苷酸化特異性因子亞基4’，CPSF4）和PfYTH.2（PF3D7_0309800，圖6c）。PfYTH.2與其他已知m6A讀取蛋白的沒有總體相似性。兩種蛋白質在IDC早期高度表達（圖6d），并且PfYTH.1的異位表達揭示了蛋白質在細胞核和細胞質中的定位（圖6e）。與IDC期間的動態表達相比，PfYTH.2在寄生蟲的傳播階段表現出甚至更高的表達，即配子體和唾液腺子孢子，后者也高度表達PfMT-A70（圖6d）。

                                              圖6 m6A與mRNA穩定性及翻譯效率的關系

結語：
該研究揭示了惡性瘧原蟲中基因表達的另一層動態和廣泛的轉錄后調節。 m6A mRNA甲基化的核心特征的保守性使惡性瘧原蟲成為研究m6A甲基化和基因轉錄之間相互作用的優良系統。此外，該研究將m6A作為瘧疾寄生蟲“上皮轉錄組”代碼的主要參與者并為瘧疾寄生蟲的藥物的發展開辟了新的途徑。