外泌體指導的細胞重編程技術，可以直接將促炎性M1原位轉化為抗炎性M2巨噬細胞

傷口愈合是一個高度程序化的過程，涉及一系列精心策劃的細胞和分子事件：止血，炎癥，增殖和重塑階段。巨噬細胞（Mφ）被認為是促進炎癥-增殖相變的關鍵因素。由特定環境信號激活的Mφ大致可分為兩個主要亞型：具有促炎特性的經典激活M1Mφ和具有抗炎和修復傷口功能的M2Mφ。因此，在特定時間點控制從M1到M2的Mφ表型轉換為傷口修復的炎癥階段向增殖階段的轉變提供了有希望的解決方案。但是，許多嘗試著重于與M2Mφ活性增加，招募更多M2Mφs或增加外源M2Mφs相關的策略，而又不影響M1Mφs。3當促炎性M1Mφ持續存在而未轉變為抗炎表型時，據信這會損害傷口愈合

今年10月份，韓國大學KU‐KIST融合科學與技術研究生院與韓國科學技術研究院（KIST）生物醫學研究所合作發表一篇“Exosome‐Guided Phenotypic Switch of M1 to M2 Macrophages for Cutaneous Wound Healing.”的SCI文章，IF= 15.804。這篇文獻提出了用外泌體引導的細胞重編程技術能將促炎性M1表型直接轉換為抗炎性M2表型以進行有效的傷口處理。M2巨噬細胞衍生的外泌體（M2-Exo）可以在體外誘導M1轉換為M2的。因為M2-Exo不僅具有Mφs重編程因子，還具有促進傷口修復的各種細胞因子和生長因子。將M2-Exo皮下給藥到傷口邊緣后，觀察到M1和M2的分別有明顯的減少和增加，外泌體成功誘導M2 Mφs增殖。傷口部位的M1直接轉化為M2 Mφs的結果是通過增強血管生成，上皮化和膠原沉積來加速傷口愈合的。外泌體具有優異的細胞重編程能力和先天生物相容性，誘導Mφs表型轉換后通過調節促炎癥與抗炎癥之間的平衡而成為各種炎癥相關病癥的希望療法。

技術路線：

一、小鼠M1和M2 M?s的建立以及M?s衍生的外泌體的表征

A）M?和外泌體制備示意圖。從BALB / c小小鼠股骨和脛骨中分離出骨髓來源的造血前體，并在存在單核細胞集落刺激因子（M-CSF）的情況下孵育7天，以促進單核細胞的分化。具有圓形和扁平形態的原代培養單核細胞開始粘附在培養皿上，并進一步分化為未定型的Mφ（M0）。在體外激活Mφ獲取促炎M1（IFN-γ激活）和抗炎M2（IL-4激活）表型。

B）Western印跡分析，證明了24h與48h時間在M1（CD86和iNOS）與M2（Arginase和 CD206）標志物表達上的差異。

C）用乙酸鈾負染后，外泌體的代表性TEM圖像。

D）使用動態光散射測量的M2-Exo尺寸分布圖。

E）外泌體的蛋白質印跡分析。從外泌體提取的等量總蛋白進行免疫印跡實驗檢測CD63，Alix，iNOS和Arginase的表達。

F）10、25、50和100 μg mL ^-1DiD標記的M2-Exo分別孵育M1 M?s1或4 h后，共聚焦圖像顯示帶有DAPI的DiD標記的M2-Exo（紅色）圖像。

G）在M1 M?s中內化的DiD標記的M2-Exo的相對熒光強度。

二、從外體引導的M1到M2 M?s的體外重編程

A）M2-Exo誘導的M?重編程插圖。

B）iNOS和Arginase在M1 M?s中分別與10、25、50和100 μg mL ^-1的M2-Exo 孵育24小時后的免疫染色。   

C）隨時間推移用50 μg mL ^-1的M2-Exo 處理的M1 M?的蛋白質印跡分析。D）FACS直方圖，顯示了用50和100 μg mL ^-1的M2-Exo 處理的M1 M?的重編程效率 

三、鑒定與M2引導M?重編程有關的主要分子和機制

通過抗體陣列和巨噬細胞重編程主要分子的鑒定確定外泌體的細胞因子表達譜。

A）144種細胞因子抗體陣列的代表性圖像。

B）比較M1-Exo和M2-Exo細胞因子的平均表達差異。

C）FACS直方圖，顯示了用M2-Exo（25 μg mL ^-1）和每種細胞因子（100 ng mL ^-1）處理的M1 M?的重編程效率。

綜上所述，M2-Exo具有關鍵的重編程因子以及各種傷口愈合因子，為傷口愈合應用中的M2-Exo引導的Mφ重編程提供了更多好處。

四、通過重編程的M2 M?s增強成纖維細胞遷移和內皮細胞管形成

RM2 M?s的體外治療作用。

A）成纖維細胞和M?s共培養插圖。

B）與M?s共培養的受傷成纖維細胞的代表性相襯圖像。

C）三種類型的M?組中傷口閉合的定量。n = 3；** p <0.01，和*** p<0.001（相對于鹽水）。

D）造成傷口后24小時，M? /成纖維細胞共培養上清液中MMP-2的水平。

E）與M?s共培養的血管內皮細胞的管形成試驗的代表性照片。

F，G）內皮細胞和M?s共培養后24 h的分支總數和管長的定量評估。n = 5；* p <0.05，** p <0.01和*** p 相對于鹽水<0.001。

五、原位外泌體表型轉換為M2 M?s的傷口愈合效應。

外泌體的體內生物分布。

A）Cy5.5‐NHS標記的外泌體的實時體內成像。皮下注射磷酸鹽緩沖液（PBS）和每100 μL外泌體100 μg后，在指定的時間對小鼠進行分析。

B）在用外泌體處理小鼠后第2天，對皮膚和主要器官進行離體成像。

C）皮下注射外泌體后第2天，外泌體的組織分布。

M2 M?s衍生的外來體促進體內傷口愈合。

A）局部注射生理鹽水，M1-Exo和M2-Exo后傷口閉合的代表性圖像

B）每4 d傷口后的傷口面積。n = 4；與鹽水相比，* p <0.05，** p <0.01和*** p<0.001。

C）傷口后第24天注射了鹽水，M1-Exo和M2-Exo的整個傷口切片的代表性照片。黑色箭頭指示傷口邊緣

RM2 M?s的體內治療作用。

A）傷后8 d小鼠皮膚組織中M1（iNOS）和M2（精氨酸酶）M?s的代表性免疫染色圖像。

B）用PBS，M1-Exo和M2-Exo（100 μg / 100 μL）對小鼠皮膚組織中iNOS和精氨酸酶表達的蛋白質印跡分析。

C）受傷和皮下注射PBS，M1-Exo和M2-Exo后24天傷口的代表性放大照片（H＆E染色）。虛線表示真皮區域，黑色箭頭表示膠原纖維。

D）使用可激活MMP-2的探針在傷口床周圍的MMP-2活性的熒光圖像。

E）受傷和皮下注射PBS，M1-Exo和M2-Exo后5 d傷口中M1和M2 M?s群體的代表性流圖。

外泌體引導的巨噬細胞重編程的示意圖。M2 M?衍生的外泌體（M2-Exo）可以誘導M1轉化為M2 M?s，并加速皮膚傷口愈合

matrix deposition ：基質沉積 ；fibroblast proliferation：成纖維細胞增殖；angiogenesis：血管增生