m6A是一種動態可逆的修飾方式，在轉錄后調控中發揮作用，其在調控基因表達、剪接、RNA 編輯、RNA 穩定性、控制mRNA壽命和降解、介導環狀RNA翻譯等方面扮演重要角色，具有重要的研究意義。國自然基金申請上，m6A RNA甲基化相關項目增長喜人。2019年有140個中標項目與m6A甲基化相關，較2018年67個中標項目，同比增長109%。文章產出上也連年增長，其高質量文章不斷。可以預見在未來三到五年內，m6A甲基化仍會是熱門研究領域，且研究產出呈爆炸增長。

   今天我們來講一篇m6A甲基化參與調節腫瘤干性和化療敏感性的文章。該文章發表于Molecular Cancer期刊，期刊影響因子為10.679，該期刊近年來影響因子逐年上漲，質量較高。文章題名為：m6A modification-mediated CBX8 induction regulates stemness and chemosensitivity of colon cancer via upregulation of LGR5。該文章講述了m6A修飾后CBX8通過上調LGR5表達調節結腸癌（CC）的干性和化療敏感性。

一、CBX8維持CC細胞的干性
   通過TCGA和GTEx數據庫分析正常結腸組織和CC組織中CBX蛋白的mRNA表達譜，發現CC組織中CBX2，CBX4和CBX8的表達顯著上調。又通過IHC檢測三種蛋白在抗化療CC組織中的表達，抗化療CC組織中CBX8的表達高于正常組織。由于化療抗性是癌癥干性的關鍵特征，因此研究了CBX8對CC細胞干性特征的影響。相對于正常上皮細胞系，CBX8在CC細胞系中過表達。抑制CBX8可降低CC細胞初級和次級成球能力；相反，過表達CBX8增強初級和次級成球能力。腫瘤干性標記包括CD133，CD44，LGR5和EpCAM，WB檢測了CBX8對腫瘤肝性標記表達調控作用。敲低CBX8顯著降低CC細胞中CD133，LGR5，CD44和EpCAM的表達，過表達CBX8顯著增加了CC細胞中干性標志物的表達。流式檢測到敲低CBX8的CC細胞減少細胞中LGR5高表達的比例，過表達結果相反。皮下成瘤實驗中，注射了敲低CBX8基因DLD-1和LoVo細胞的小鼠的腫瘤發病率明顯降低。成球實驗表明，LGR5+細胞比LGR5-細胞表現出更強的成球能力。LGR5+細胞有助于小鼠的腫瘤形成，并表現出較強的抗細胞凋亡的能力（通過L-OHP或CPT-11誘導）。

二、CBX8抑制CC細胞對L-OHP和CPT-11的化療敏感性
   由于敲低CBX8抑制CC細胞的干性，接下來檢查CBX8是否會影響CC細胞的化療敏感性。敲低CBX8的CC細胞在L-OHP和CPT-11處理下，表現出較差的集落形成能力和較高的細胞凋亡率。過表達CBX8后，結果相反。結果表明，CBX8敲低或過度表達與化療藥物有協同作用。為了進一步研究CBX8敲低是否影響化療敏感性，通過慢病毒干擾CBX8表達。結果表明，敲低CBX8表達可有效抑制腫瘤生長；shCBX8與L-OHP或CPT-11的結合對腫瘤生長的抑制作用比任何單獨的治療都要強。IHC結果確認了CBX8的表達被shCBX8干擾，并且shCBX8與L-OHP或CPT-11的組合促進了細胞凋亡。綜上所述，這些數據表明病毒介導的CBX8沉默增加了CC細胞對L-OHP和CPT-11的化療敏感性。

三、LGR5為CBX8的靶標并介導CBX8誘導的CC細胞干性
   通過轉錄組測序確定干擾CBX8和對照細胞的mRNA表達譜。敲低CBX8導致2234個基因的上調和3410個基因的下調。GSEA分析結果表明，差異表達的基因集顯著與癌癥干性和侵襲相關。使用ChIP-seq方法確定了CC細胞中CBX8的全基因組靶位，CBX8優先分布在基因的轉錄起始位點（TSS）附近。GO）分析結果表明，CBX8結合基因的最重要生物學功能包括轉錄的正調控，Pol II調控區序列特異性DNA結合和轉錄corepressor活性。分析了敲除CBX8后差異表達基因與ChIP-seq數據之間的重疊基因集，發現46個上調基因包含在CBX8目標基因集中，而83個下調基因包含在CBX8目標集中基因。重要的是，LGR5位于83個下調的靶基因中，因此推測CBX8可以參與調控LGR5。
   為了進一步評估LGR5對CBX8介導的干特性的影響，用LGR5過表達質粒轉染了CBX8敲低的CC細胞。LGR5的過表達恢復了CBX8耗盡誘導的干標記表達，球體形成能力和對L-OHP和CPT-11的化療敏感性的變化。相反，LGR5敲低挽救了CBX8過表達誘導的干性標記表達，球體形成能力和化療敏感性的變化。這些結果證實，CBX8可通過LGR5促進癌癥干并抑制化療敏感性。

四、CBX8通過以經典途徑與pol II相互作用調節LGR5轉錄
   接下來，研究了CBX8促進LGR5表達的潛在機制。qRT-PCR的結果證實，敲低CBX8導致LGR5表達降低，而過表達CBX8導致LGR5表達升高，表明CBX8在轉錄水平上調節了LGR5表達。ChIP-seq結果表明，CBX8在LGR5的啟動子上富集。使用MEME來分析識別CBX8的結合基序，預測出五個高度相關結合序列，其中第四個基序中富含LGR5啟動子，可能在LGR5的轉錄調控中起關鍵作用。為了確定是否存在CBX8響應區域，構建了三個熒光素酶報告基因，其中包含LGR5啟動子的不同片段。螢光素酶報告基因分析的結果表明，CBX8敲低顯著降低了由-591/267片段驅動的螢光素酶活性；而CBX8過表達增強了由該片段驅動的螢光素酶活性。這些結果證實，CBX8啟動子的-591/267區含有CBX8響應位點。然后，我們構建了針對LGR5啟動子不同區域的七對引物。結合的ChIP和qPCR分析顯示，CBX8結合到CBX8啟動子中的區域2–5，該區域包括在-591 / 267個片段。Pol II抑制可抑制具有或不具有CBX8過表達的DLD-1細胞中的LGR5活化，ChIP-seq數據表明LGR5 啟動子中Pol II高度富集，CoIP分析結果表明CBX8結合了DLD-1細胞中的Pol II。敲低或過表達CBX8，并進行ChIP-PCR分析。結果顯示，敲低CBX8時，CBS2和CBS4上Pol II的占用率降低。相反，在CBX8過表達后，發現Pol II在CBS2和CBS4處的占用增加。作者還研究了CBX8是否以經典的PRC1依賴性方式促進LGR5轉錄。為此，敲低DLD-1細胞中Ring1b的表達，但Ring1b的敲低并未干擾LGR5的表達，這表明CBX8介導的LGR5激活不涉及PRC1的經典機制。

五、CBX8通過與KMT2b結合而在LGR5啟動子上維持H3K4me3
   為了深入了解CBX8調控LGR5表達的機制，使用UCSC確定是否存在組蛋白修飾（H3K4me3、H3K27me、3H3K27Ac）。H3K4me3和H3K27Ac標記轉錄激活，而H3K27me3標記轉錄抑制。結果發現高富集的H3K4me3和H3K27me3的峰重疊。ChIP分析用于進一步確定CBX8是否通過組蛋白修飾調節LGR5。在LGR5啟動子處，CBX8的敲低和過表達分別降低和增加了H3K4me3的表達，而CBX8敲低并沒有改變H3K27me3或H3K27Ac的表達。這些數據暗示在LGR5啟動子上的H3K4me3修飾是CBX8介導的LGR5激活的原因。來自ENCODE的ChIP-seq數據顯示KMT2b富含LGR5啟動子，干擾KMT2b不會降低LGR5表達。WB結果顯示，過表達CBX8并敲低KMT2b-抑制LGR5活化。此外，CoIP檢測結果顯示CBX8在DLD-1細胞中與KMT2b相互作用。當這些標記的蛋白在HEK293細胞中共表達時，CoIP鑒定了CBX8和KMT2b之間的相互作用。為了進一步評估KMT2b在CBX8介導的LGR5表達中的作用，我們通過ChIP-qPCR重新檢查了LGR5啟動子的七個區域，ChIP分析表明，KMT2b在區域3、5和6中顯著富集。敲低CBX8降低了KBS1和KBS2處KMT2b的結合率，而KMT2b耗盡抑制了KBS1和KBS2處KMT2b和H3K4me3的富集。這些結果表明，CBX8導致KBS1和KBS2處的KMT2b積累，以維持H3K4me3修飾狀態。為了進一步確認KBS1和KBS2是否是促進LGR5表達的關鍵位點，我們構建了幾種螢光素酶報告基因質粒，該質粒包含帶有或不帶有KBS1和KBS2突變的各種啟動子區域。當KBS1或KBS2發生突變或KBS2被刪除時，CBX8基因敲除和過表達分別降低和增加報告基因活性。在LGR5啟動子中構建了KBS1突變和KBS2缺失的質粒，發現CBX8的敲除和過表達都不會影響報告基因的活性。這些結果表明，在CC細胞中，CBX8將KMT2b募集到KBS1和KBS2，從而通過H3K4me3促進LGR5轉錄。
   為了鑒定CBX8與KMT2b結合的結合域，我們克隆了5個帶有Flag標簽的CBX8構建體，并用截短的質粒轉染了DLD-1細胞。用抗-Flag抗體對細胞提取物進行IP。Flag-CB4與癌細胞中的KMT2b相互作用，表明與KMT2b相互作用需要CBX8氨基酸214和300之間的結構域。

六、Mettl3誘導的m 6 A修飾參與CBX8的上調
   導致CBX8異常表達的機制尚不清楚。RMBase預測顯示，許多高度可信的m6A位點分布在CBX8 mRNA中，因此推測CBX8的上調是否依賴于m6A修飾。MeRIP與qRT-PCR結合顯示，DLD-1和SW480細胞中m6A的富集程度明顯高于正常NCM460細胞。TCGA數據庫中評估了Mettl3表達以及Mettl3和CBX8表達之間的相關性。值得注意的是，Mettl3在CC組織中顯著上調，并且Mettl3表達與CBX8表達正相關。敲低Mettl3明顯降低了CBX8 mRNA和蛋白質水平，相反，過表達Mettl3增加了CBX8的mRNA和蛋白質表達水平。MeRIP PCR也表明，敲低Mettl3降低CBX8 mRNA的m6A甲基化水平。敲低Mettl3導致CBX8 mRNA的穩定性降低，而Mettl3過表達則可以提高CBX8 mRNA的穩定性。這些結果揭示了Mettl3通過促進CC細胞中的m6A修飾來維持CBX8 mRNA的穩定性。
使用RMBase 預測了CBX8 m 6 A位點的潛在讀者，發現IGF2BP1確實在CBX8 mRNA上具有結合位點。RIP分析證實了CC細胞中IGF2BP1和CBX8 mRNA之間存在直接相互作用，敲低IGF2BP1會顯著降低CBX8蛋白表達水平。敲低IGF2BP1后，CBX8 mRNA的中位半衰期明顯縮短；敲低Mettl3后，IGF2BP1和CBX8 mRNA之間的相互作用受到損害。這些數據表明，IGF2BP1與CBX6 mRNA結合，以m6A依賴的方式增強其穩定性。

七、CC中Mettl3 / CBX8 / LGR5軸的臨床意義
   qRT-PCR和WB驗證臨床CC樣本中CBX8表達，IHC結果證實高表達CBX8主要定位于在CC組織細胞核。化學抗性CC組織中的CBX8表達高于化學敏感的CC組織。數據庫分一下預后相關性和生存曲線。IHC結果顯示，化療抗性患者CBX8，Mettl3，LGR5，CD133和CD44表達水平較高。

    最后今天就看到這里，下回帶大家看點別的，再見！！