導語：
   肺癌具有潛在的惡性和異質性特點，尤其難以診斷, 因此，需要開發無創的肺部毛玻璃樣結節GGNs診斷方法和風險層理方法。血漿胞外囊泡(EVs)來源的miRNA對孤立性肺結節(SPNs)，尤其對毛玻璃結節(GGNs)的臨床診斷和分子特征提供了可行性思路。然而，回顧性研究固有的選擇性偏見和不太嚴格的識別方法對研究有存有一些局限性。 因此，有待對照研究比較惡性孤立性肺結節(SPNs)與良性疾病之間的差異。
技術路線：
1.收集病人血漿樣本，并分離血清
2.分離血漿EV，納米顆粒跟蹤分析(NTA)EVs的數目大小，EVs表征等
3.掃描電鏡(SEM)掃描電鏡分析，然后從血漿EVs中分離RNA。
4.小RNA文庫的制備和測序
5.miRNA-seq數據的生物信息學分析。
6.EVs miRNA在三個惡性結節亞群中的表達特點
7.惡性結節分層的生物學分析。
8.術前和術后血漿樣本miRNA譜的比較
研究結果：
1.患者及臨床病理資料
   共納入99例患者，其中良性結節20例(20.2%)。其他樣本被診斷為腺癌，范圍從原位腺癌(AIS)到侵襲性腺癌。79例惡性腫瘤標本中16例為pGGNs, 21例為mGGNs, 42例為實性結節，其中20例為術后血漿標本。

2.Evs表征
   使用Western blotting評估了7個代表性EV樣本中的幾個囊泡標記，包括Alix、TSG101、Syntenin、CD9和Calnexin。此外，為了表征等離子體中電動汽車的濃度和尺寸，使用了Nanosight NS300系統進行納米顆粒跟蹤分析。結果表明，分離出的囊泡大部分在100 nm左右，這是典型的外泌體大小。另外，兩個典型EV樣品的SEM圖像如下圖所示。

3.歸一化、穩定化和組合來構造SVM分類器
   使用映射率大于90%的樣本，設置了5個映射和表達的讀取作為截止點。將其作為兩個miRNAs的比值進行分析，其中一個miRNA被認為是靶基因，其他miRNA被認為是參考基因。使用兩對miRNA的比值來構建一個二維空間，SVM可以用來確定區分良惡性結節的最佳cut-off。miR - 185 - 5 - p / miR-32-5p和miR - 140 - 3 - p / let-7f-5p SVM模型顯示診斷價值最高,敏感性和特異性的85.1%和75%,分別在參照集和59.3%和100%,分別在驗證集。此外, miRNA的結合靈敏度最高的miR-27a-5p / miR - 550 - 5 - p和miR - 1908 - 5 - p / miR - 98 - 5 - p。該組合在訓練集和驗證集的敏感性分別為100%和96.9%。此外，特異性最高的miRNA組合為miR-185-5p/miR-378i和miR-495-3p/miR-99b-3p。這種組合在參照集和驗證集的特異性都是100%。

4. EVs miRNA在三個惡性結節亞群中的表達特點
   為了進一步評估血液EVs miRNA表達譜的潛在分類價值，術前對所有來自惡性結節患者的樣本進行PCA分析。pGGN樣品與固體樣品的分布比較明顯。pGGN樣品主要集中在中心區域，而固體樣品分為兩組。有趣的是，表皮生長因子受體基因19外顯子小缺失的12個實性結節中有11個被歸為1類;這明顯高于第二組。mGGN樣品也可以與固體樣品歸為同一類。這些結果揭示了血液EVs miRNAs中惡性結節的復雜性。

5. 惡性結節分層的生物學分析
   選擇絕對權重大于0.05的1組和2組差異表達的miRNA。通路富集分析顯示，這些miRNA主要針對癌癥相關通路，如細胞周期和粘附連接。有趣的是，miR-500a-3p、miR-501- 3p和miR-502-3p三種不同的陽性表達的miRNA對肺腺癌患者在腫瘤組織中的生存具有很強的危險比。相反，負權數高的miRNA并沒有顯示出顯著的危險比。miR-500a-3p、miR-501-3p和miR-502-3p位于CLCN5內含子的近端，可能是協同調控的。與第二組相比，第一組這三種miRNA均上調，p值顯著(p < 0.001, p < 0.001, p < 0.001);。有趣的是，TCGA中這三種miRNAs在腫瘤組織中的上調與這些miRNAs下調后腫瘤組織中觀察到的更好的總體生存相關。總的來說，1組實性結節血液EVs中這3種miRNA的上調與患者預后的改善有關。

 

6. 術前和術后血漿樣本miRNA譜的比較
   通過比較術前和術后血液EVs的miRNA表達譜，發現9種miRNA在術前和術后有顯著的差異表達。在這些miRNA中，miR-320b和miR- 128-3p在1組和2組實性結節中也有差異表達。miR-320b在與細胞增殖相關的Hippo信號通路中富集。然而，miR-128-3p的靶點沒有富集通路。這些數據表明，1組和2組實性結節可能來自不同的致癌途徑。此外，miR-500a-3p、miR-501-3p、miR-502-3p在術后均有上調，其邊緣p值分別為(p = 0.058、p = 0.011、p = 0.020)，提示miR-500a-3p、miR-501-3p、miR-502-3p的常表達可能與腫瘤進展相關。

總結： 
   評估了血漿胞外囊泡(EVs)來源的miRNA對孤立性肺結節(SPNs)，尤其是毛玻璃結節(GGNs)的診斷價值和分子特征。對59例患者(包括12例良性結節患者)的血漿EVs miRNA進行小RNA測序(2017，參照集)。對另外40個個體的MiRNA譜進行了測序(2018年，驗證集)。總的來說，包括16例單純ggn、21例混合ggn和42例實性結節，20例患者術后可獲得配對的血漿樣本。利用靶miRNA/參考miRNA比值構建支持向量機(SVM)模型。特異性最好的SVM模型在參照集和驗證集的特異性分別為100%。靈敏度最好的模型在訓練集和驗證集的靈敏度分別為100%和96.9%。主成分分析顯示，純GGN分布與實性結節不同，混合GGN呈彌散分布。在差異表達的miRNA中，miR-500a-3p、miR-501-3p和miR-502-3p在腫瘤組織中表達上調，總體生存期提高。SVM分類器能準確區分惡性ggn和良性結節。其獨特的輪廓特征為EVs miRNA作為肺癌預后因子的可行性提供了思路。
   總之，提供了一種穩定且有價值的基于血漿EVsderived miRNAs的SVM分類器模型，用于區分惡性GGNs和良性結節(最高特異性為100%;最高靈敏度:98.9%)。此外，還發現了純GGNs、混合GGNs和固體樣品中miRNA表達譜的明顯特征。我們認為開發一種有效的、無創的診斷和風險分層模型對臨床醫生有幫助。