Hippo信號通路在發育和癌癥進展中起著關鍵作用。然而，本質上抑制這種途徑的分子還不太為人所知。“Kindlin-2 Inhibits the Hippo Signaling Pathway by Promoting Degradation of MOB1”一文研究報道了黏著斑分子Kindlin-2通過與MOB1相互作用并降解MOB1和促進MOB 1與E3連接酶praja2之間的相互作用來抑制希波信號傳導。Kindlin-2因此抑制LATS1和YAP的磷酸化，并促進YAP轉位入核，在核中激活下游Hippo靶基因轉錄。Kindlin-2缺失激活Hippo/YAP信號并減輕單側輸尿管梗阻的Kindlin-2敲除小鼠的腎纖維化(單側輸尿管阻塞)。而且，腎纖維化患者樣本中Kindlin-2水平與MOB1和磷酸化YAP呈負相關。

文章亮點:

1.Kindlin-2通過其E3連接酶praja2介導MOB1蛋白酶體降解
2.Kindlin-2通過促進MOB1的降解抑制YAP的磷酸化
3.Kindlin-2耗竭激活Hippo途徑，減輕單側輸尿管阻塞誘導的腎纖維化
4.長效Kindlin-2 siRNA對單側輸尿管阻塞誘導的腎纖維化具有治療價值

圖形摘要:

結果:

一、Kindlin-2與MOB1相互作用并抑制Hippo信號通路的激活
   Kindlin-2在質譜分析中被鑒定為與MOB相互作用，表明Kindlin-2參與了Hippo信號通路。此外，內源性MOB1在HEK293T細胞中與Kindlin-2和FLAG-Kindlin-2共免疫沉淀(圖1A和1B)。相反，內源性Kindlin-2在HEK293T細胞中被MOB1共免疫沉淀(圖1C)。這些結果表明Kindlin-2和MOB1在活細胞中相互作用。谷胱甘肽轉移酶(GST)下拉結果顯示MOB1與Kindlin-2的氮端和中間區都有很強的相互作用，而與碳端的相互作用很弱。免疫熒光染色顯示Kindlin-2和MOB1共定位于HK2細胞的細胞質(圖1d)。上述數據表明Kindlin-2直接與MOB1相互作用。接下來確定Kindlin-2和Hippo信號通路之間是否存在調節關系(圖1e和1F)。Kindlin-2過表達導致MOB1、pMOB-35、pLATS1-909和pYAP-127水平下降。然而，對經前S1、經前T1、經后T1、經前S1或經后葉無明顯影響。Kindlin-2表達的減少導致MOB1、pMOB-35、pLATS1-909和pYAP-127水平的增加，這表明希波信號的激活，但是沒有觀察到對pMST1、MST1、LATS1或YAP的明顯影響(圖1E和1F)。此外，Kindlin-2過表達導致HKC和HEK293A細胞核中YAP水平升高，而Kindlin-2表達降低導致細胞核中YAP水平降低, 核中的YAP水平是根據Kindlin-2功能的獲得或喪失(圖1G)。qPCR顯示Kindlin-2過表達促進CTGF和CYR61mRNA表達。相反，Kindlin-2的表達減少受到抑制CTGF和CYR61mRNA表達(圖1H)。因此，Kindlin-2抑制MOB1的表達和磷酸化。MOB1水平的降低會抑制LATS1的完全磷酸化；YAP的去磷酸化促進其向細胞核的轉移，在細胞核中它促進下游靶CYR61和CTGF的轉錄。該機制在中建模圖1. 雖然Kindlin-2不影響YAP的水平，但Kindlin-2可能通過不同的上游機制調節Hippo/YAP信號通路。

                                                      圖1. Kindlin-2與MOB1相互作用并抑制Hippo(Hippo)通路的激活

二、Kindlin-2介導MOB1蛋白酶體降解
   Kindlin-2不影響MOB1HEK293T或HKC細胞中的轉錄(圖2A和2B)。探討Kindlin-2介導MOB1降解的機制發現，在HEK293T細胞中過表達的FLAG-Kindlin-2以劑量依賴性方式顯著降低內源性MOB1的蛋白水平(圖2C)。此外，Kindlin-2降低MOB1水平的作用通過用MG132蛋白酶體的抑制劑 (圖2D)，表明Kindlin-2對MOB1降解的影響是由蛋白酶體蛋白降解途徑介導的。使用Cycloheximide追蹤試驗測量了Kindlin-2存在或不存在時MOB1的周轉率發現，與在HEK293T和HKC細胞中使用空載體相比，用Kindlin-2轉染導致內源性MOB1的半衰期顯著減少(圖2E和2F)。與在HEK293T細胞中使用空載體時相比，用Kindlin-2小干擾核糖核酸 (siRNA) 轉染導致內源性MOB1的半衰期顯著增加(圖2G和2H)。這些結果表明Kindlin-2通過蛋白酶體蛋白降解途徑介導MOB1降解。機制模型圖( 圖?2I).

                                                                圖2  Kindlin-2介導MOB1蛋白酶體降解

三、Kindlin-2通過增強MOB1與praja2的結合來介導MOB 1的降解
   Kindlin-2作為銜接蛋白不能直接降解MOB1。為了確定Kindlin-2是否通過praja2降解MOB1，發現praja2與FLAG-Kindlin-2共免疫沉淀(圖3A)和HEK293T細胞中內源性Kindlin-2(圖3B)。為了確定Kindlin-2和praja2之間結合所涉及的蛋白質區域，合成并表達了FLAG-praja-2的四個完整或截短版本:全長praja 2(aa 1–708)、aa 1–530區域、aa 531–708區域或aa 1–630區域(圖3C)，外源表達的GFP-Kindlin-2與全長FLAG-praja2(1–708)和aa 1–530區(圖3D)。此外，雙重免疫染色顯示Kindlin-2和praja2共定位于HK2細胞的細胞質(圖3E)。兩步共免疫沉淀(coIP)分析，確定Kindlin-2、MOB1和praja2三種分子形成復合物(圖3F)。Kindlin-2過表達增加了HEK293T細胞中MOB1與抗praja2抗體共免疫沉淀的量，而Kindlin-2缺失顯示了相反的作用(圖3G和3H)。Kindlin-2的過表達降低了pYAP、MOB1和pMOB1的水平，而Kindlin-2的過表達和praja2的同時缺失部分挽救了pYAP、MOB1和pMOB1的水平(圖3I)。Kindlin-2通過praja2介導的腎細胞MOB1降解下調YAP磷酸化。這些結果表明Kindlin-2構成了praja2和MOB1之間的橋梁，增強了它們的相互作用，促進了MOB1的降解；模型圖(圖3J).

                                                                圖3  Kindlin-2增強MOB1和praja2之間的相互作用

四、Kindlin-2缺失激活單側輸尿管阻塞誘導Kindlin-2敲除小鼠腎纖維化中的Hippo信號
   由于Kindlin-2完全缺失的胚胎致死性，Kindlin-2敲除第一鼠標模型只能獲得雜合子小鼠。基因型和Kindlin-2缺失效率被證實(圖4A—4D)。Kindlin-2水平在單側輸尿管阻塞之后顯著增加。此外，在單側輸尿管阻塞，Hippo信號通路與MST1、pMST1、pMOB1、LATS1、pLATS1、YAP和pYAP的上調和MOB1的下調一起被激活(圖4E和4F)。然而，Kindlin-2敲除小鼠中Kindlin-2的缺失導致了Hippo信號通路的更多磷酸化和激活(伴隨著pMOB1、pLATS1和pYAP的增加；p %3C 0.05)，比在單側輸尿管阻塞(圖4E和4F)。免疫組織化學(IHC)和免疫熒光染色表明Kindlin-2的缺失激活了Hippo途徑，但不影響單側輸尿管阻塞(圖4G)。此外，與野生型單側輸尿管阻塞小鼠相比，Kindlin-2敲除單側輸尿管阻塞小鼠顯示腎纖維化標志物α-SMA、纖連蛋白和間充質標志物波形蛋白水平降低，但上皮標志物E-鈣粘蛋白水平升高。與對側相比，在野生型單側輸尿管阻塞小鼠中occludin和claudin-3明顯下調，而在Kindlin-2敲除單側輸尿管阻塞小鼠中，這種明顯的下調得到緩解。除了Hippo途徑，Wnt途徑在單側輸尿管阻塞之后被激活；而Kindlin-2敲除單側輸尿管阻塞小鼠與野生型單側輸尿管阻塞小鼠相比，其TCF4和β-連環蛋白水平降低(圖4E和4F)。Kindlin-2的過度表達導致了上皮鈣粘蛋白水平的降低，但是纖維連接蛋白、膠原蛋白ⅰ和α-形狀記憶合金(圖4H，左側)。相反，Kindlin-2表達的減少恢復了這些標記物的水平(圖4H，對)。Kindlin-2 siRNA轉染后，我們在HKC細胞中過表達YAP。這些結果表明YAP的過度表達逆轉了由Kindlin-2缺失引起的ⅰ型膠原和α-SMA的減少(圖4I)，提示Kindlin-2通過Hippo/YAP途徑促進腎纖維化。這部分在中建模圖4J.

                                           圖4  Kindlin-2缺失激活Kindlin-2基因敲除小鼠單側輸尿管阻塞誘導的腎纖維化中的Hippo/YAP信號傳導

五、長期siRNA誘導Kindlin-2耗竭抑制單側輸尿管阻塞小鼠模型Hippo靶基因CTGF的上調
   在單側輸尿管阻塞小鼠模型中設計了兩個使用長效Kindlin-2 siRNAs的治療實驗。第一個實驗，我們在單側輸尿管阻塞后7天以上給野生型小鼠施用了5 nmol長效Kindlin-2 siRNA或對照siRNA(圖5A).一般來說，晚期治療組(第5組)和陰性對照組(第6組)的腎體積大于早期治療組(第1-3組)。蛋白質印跡顯示Kindlin-2被成功敲除，Kindlin-2的耗盡降低了CTGF和α-形狀記憶合金水平(圖5B和5C)。此外，形態學檢測顯示單側輸尿管阻塞腎臟(組1-5)比對照組(組6；圖5D)，表明用長效Kindlin-2 siRNA治療減輕了腎纖維化，早期治療產生了更好的結果。在第二個實驗中，證明了5 nmol長效Kindlin-2 siRNA或對照siRNA對單側輸尿管阻塞后7天的野生型小鼠的作用(圖5E)。蛋白質印跡顯示Kindlin-2被成功耗盡，Kindlin-2的低水平導致CTGF、纖連蛋白和α-形狀記憶合金的水平降低(圖5F)。形態學檢測顯示Kindlin-2 siRNA組的單側輸尿管阻塞腎纖維化癥狀比對照組siRNA較輕(圖5G)。基于這些發現，提出了一個工作模型，其中給予長效Kindlin-2 siRNAs通過三種主要的信號通路(圖5H)。

                                                  圖5  長效Kindlin-2 siRNA對單側輸尿管阻塞腎纖維化的治療作用

六、人腎纖維化標本中Kindlin-2水平與MOB1和pYAP水平呈負相關
   與正常腎組織相比，腎纖維化組織中Kindlin-2、pYAP、YAP和CTGF水平較高，但MOB1水平較低(圖6A和6C)。這些觀察結果與單側輸尿管阻塞模型中發現的結果一致(圖4E)。此外，發現腎纖維化患者腎小管中Kindlin-2水平與MOB1和pYAP水平呈負相關，總YAP水平無顯著變化(圖6B和6D)。在Kindlin-2水平較高的腎小管細胞核中檢測到的YAP水平高于Kindlin-2水平較低的細胞核(圖6B和6D)。這些數據支持Kindlin-2與MOB1和pYAP負相關，并促進人腎纖維化中YAP的核轉位。對正常腎和腎透明細胞癌TCGA數據的分析揭示了以下基因表達的正相關性FERMT2和YAP下游基因CTGF和CYR61(圖6E–6H)。然而，在正常腎臟TCGA數據庫分析中，FERMT2與YAP沒有關聯(圖6I)。相反，通過分析腎透明細胞癌TCGA數據庫，FERMT2被發現與YAP有關(圖6J)。這些結果表明Kindlin-2在生理和病理條件下通過不同的分子機制調節Hippo/YAP信號通路。此外，Hippo/YAP的目標基因，CTGF和CYR61，與FERMT2正相關在正常腎組織和腎透明細胞癌組織中。無論何種條件，Kindlin-2都能促進YAP核轉位，上調Hippo靶基因。

                                                    圖6 Kindlin-2與人腎纖維化組織中Hippo/亞磷脂活化負相關
結論:
  表明Kindlin-2 通過MOB1的降解抑制Hippo信號傳導。針對Kindlin-2 的特定長效siRNA有效緩解了單側輸尿管阻塞誘導的腎纖維化，并可能成為腎纖維化的潛在療法。