卵巢早衰（POI）的遺傳病因至今已被證實，但lncRNAs在POI中的作用尚不清楚。那么，小編給大家介紹發表在“Nucleic Acids Research”上的文章“Long noncoding RNA HCP5 participates in premature ovarian insufficiency by transcriptionally regulating MSH5 and DNA damage repair via YB1”，讓大家詳細了解LncRNA HCP5在POI中的作用機制。

     在本研究中，我們在生化性POI（bPOI）患者的顆粒細胞（GCs）中發現了一種低表達的lncRNA HCP5，它破壞了DNA損傷修復，促進了GCs的凋亡。在力學上，我們發現HCP5穩定了Nyb1和ILF2之間的相互作用，它可以介導YB1向GCs核的轉移。HCP5沉默影響了YB1在細胞核中的定位，降低了YB1與MSH5基因啟動子的結合，從而降低了MSH5的表達。

結果：

1.bPOI患者顆粒細胞中lncRNA HCP5表達下調

    為了探討異常表達的lncRNAs與POI的關系，我們首先對bPOI患者和正常人的顆粒細胞進行了微陣列分析。我們發現159個lncRNA在患者和對照組之間有差異表達（圖1A，B）。在這些候選基因中，我們只考慮與POI相關基因共定位和共表達的lncRNA。lncRNA HCP5來自6號染色體MSH5基因上游276kb，是唯一一個POI基因共定位的lncRNA（圖1C）。定量RT-PCR分析證實，bPOI患者和對照女性的GCs中HCP5的表達存在差異（圖1D）。此外，我們的結果表明，HCP5在21周人胎兒的多個組織中廣泛表達，在卵巢中表達相對較高（圖1E）。采用熒光原位雜交（FISH）技術檢測HCP5的亞細胞定位。結果表明，HCP5主要位于細胞核內，尤其是在KGN、COV434和SVOG細胞的核膜周圍（圖1F），細胞分離結合qPCR分析進一步證實了這一點（圖1G）。

2.HCP5調節顆粒細胞MSH5的表達

    據報道，LncRNAs在其鄰近基因中起到順式調節作用。鑒于HCP5與MSH5的相鄰定位，我們提出HCP5可能參與MSH5的表達調控。RT-qPCR結果顯示bPOI女性GCs中MSH5較對照組下調（圖2A），這與HCP5的表達一致。此外，在KGN細胞中敲除HCP5導致MSH5在mRNA和蛋白質水平上的表達明顯降低（圖2B，C）。由于lncRNA-HCP5能在轉錄水平上調控MSH5的表達，故進一步研究HCP5是否與MSH5-mRNA在GCs中共同表達。我們檢測了GCs患者和正常人GCs中HCP5和MSH5的表達。如圖2D所示，lncRNA HCP5與MSH5 mRNA水平顯著相關。這些結果表明HCP5在調節MSH5表達中起著重要作用。

3.MSH5是DNA雙鏈斷裂（DSBs）修復過程中HCP5的靶點  

    MSH5主要參與錯配修復，MSH4-MSH5雜二聚體在DSBs的同源重組（HR）修復中起重要作用。通過免疫熒光法發現DSBs的敏感指標γH2AX隨修復過程逐漸消失（圖3A）。western blot檢測γH2AX蛋白水平。結果表明，HCP5基因敲除明顯延長了ETO誘導的KGN、COV434和SVOG細胞DSB修復的時間（圖3B）。鑒于MSH5在DSBs的HR途徑中的重要作用，我們研究了HCP5基因敲除對喜樹堿（CPT）誘導的DNA損傷修復的影響。與ETO處理一致，γH2AX病灶被觀察到， 并隨著恢復逐漸消失（圖3C）。此外，沉默HCP5明顯延長了CPT誘導的KGN、COV434和SVOG細胞DSB修復的時間（圖3D）。此外，HCP5基因的敲除顯著增強了ETO誘導的細胞凋亡（圖3E）。

4.HCP5直接與YB1結合，是其核定位的關鍵

    為了研究HCP5的蛋白伴侶，采用生物素標記的HCP5全長轉錄物及其反義轉錄物進行RNA下拉和MS聯合檢測。如圖4A所示，銀染后在50kDa處可見一條不同的HCP5結合蛋白帶。Western blot證實YB1在HCP5下拉蛋白中富集（圖4A）。由于RNA下拉實驗揭示了HCP5-YB1在體外的相互作用，我們采用RNA結合蛋白免疫沉淀法（RIP）檢測HCP5與YB1之間的內源性聯系。用抗YB1抗體進行RIP檢測，然后進行qRT PCR，證實了KGN、COV434和SVOG細胞中HCP5和YB1之間的直接相互作用（圖4B）。然后我們探討了HCP5對其結合蛋白YB1的調節作用。HCP5的敲除并沒有改變YB1在mRNA或蛋白質水平上的表達（圖4C，D），表明HCP5并不影響YB1在KGN細胞中的整體表達。考慮到YB1的活性主要取決于它在細胞核和細胞質之間的穿梭，進一步研究了HCP5是否參與了YB1的細胞定位。我們檢測了HCP5沉默后KGN細胞核質部分YB1的表達。Western blot顯示YB1存在于KGN細胞的細胞核和細胞質中；然而，HCP5沉默明顯減少了YB1在細胞核中的存在（圖4E）。免疫熒光分析表明YB1蛋白的核染色減少，排除了HCP5敲除時YB1的核仁定位（圖4F、G）。這些結果表明HCP5沉默阻止了YB1向細胞核的轉運。

5.HCP5作為ILF2和YB1的RNA支架，對YB1定位到細胞核至關重要

    在機制上，目前還不清楚HCP5是如何誘導YB1定位到細胞核的。考慮到ILF2可以與YB1相互作用并調節其核定位，我們采用共免疫沉淀的方法來評估HCP5對YB1 - ILF2復合物的影響。結果表明，HCP5的敲除降低了YB1抗體共沉淀的ILF2的相對量（圖5A）。考慮到HCP5在細胞核，特別是核膜中的定位，我們推測HCP5可能是YB1和ILF2之間的一種模塊化支架。因此，我們進行了RIP分析以確認HCP5和ILF2之間的相互作用。如預期，抗ILF2抗體在KGN、COV434和SVOG細胞中共沉淀HCP5（圖5B）。此外，我們觀察到在RNase A處理后YB1和ILF2之間的聯系減弱，這進一步驗證了RNA支架在YB1-ILF2相互作用中的重要作用（圖5C）。最后，ILF2沉默導致YB1的核定位顯著降低，這與HCP5基因敲除時的結果一致（圖5D-F）。因此，HCP5可以作為YB1和ILF2相互作用的RNA支架，并可能對YB1的核定位負責。

6.HCP5基因敲除降低了與MSH5啟動子的YB1結合并抑制了MSH5的轉錄激活

    核YB1可以定位到啟動子或其他關鍵調控區的目標基因，并開始轉錄。我們進一步探討了HCP5敲除是否影響了MSH5啟動子對YB1的占用。染色質免疫沉淀（ChIP）分析和qPCR顯示YB1在MSH5啟動子上顯著富集（圖6A）。此外，HCP5的敲除顯著降低YB1與MSH5啟動子的結合（圖6B）。接著，我們研究了HCP5基因敲除對RNA PolⅡ與MSH5啟動子結合的影響。如圖6C所示，HCP5沉默導致RNA Pol II與MSH5啟動子的結合減少，這與HCP5 shRNA對MSH5 mRNA水平的抑制一致。綜上所述，HCP5通過促進YB1和RNA PolⅡ向MSH5啟動子的募集來調控MSH5的轉錄。

結論：我們闡明了LncRNA HCP5對人類POI的作用機制，即HCP5通過直接與YB1結合并調控其亞細胞定位來調節MSH5的表達和GCs的功能。本研究為POI的發病機制提供了一種新的表觀遺傳學機制。