CircRNA在多種疾病中發揮著重要的調控作用，但circRNA在肝纖維化（HF）中的表達譜和功能仍未解決，本文在一定程度上回答了此問題，并在2020年3月26發表于《Theransotics》雜志上。
本文主要結果如下：
1、HSCs小鼠的circRNA的表達譜
    為了研究參與HF的circRNA的表達譜，使用RNA- Seq分析了原代肝星狀細胞（HSC）三個階段的（媒介期，HF進展期和HF消退期）表達譜。圖1A是動物處理的示意圖，圖1B表明小鼠三個時期的病理特征符合預期，肝纖維化和損傷期小鼠HF加重，而HF恢復后減輕。圖1C-D顯示纖維發生因子的表達量在HF小鼠的HSC中持續高表達而在HF恢復的小鼠中則下降。此外，共鑒定4343個差異表達的circRNA。

                                              圖1 HSCs小鼠的circRNA的表達譜
2、CircFBXW4的表達在HF的小鼠中下降，在HF恢復的小鼠體內表達恢復
    盡管根據表達豐度和外顯子的類型篩選到27個差異表達的circRNA，其中在肝纖維組上調的11個和下調的16個。PCR驗證后只有8個的表達與RNA測序一致（圖2A），其中與媒介期相比，circFBXW4在HF中顯著下調表達。因此，作者選定它為下一步研究對象。此外，小鼠的肝臟急性損傷模型的研究中發現circFBXW4的表達顯著下調（圖2B-D）。circFBXW4的表達在肝纖維時下降在HF恢復處理后表達上調（圖2E），且circFBXW4的宿主基因FBXW4的表達呈現出一致的趨勢（圖2G）。此外，人體中的研究結果與小鼠體內類似，與健康對照組相比，人纖維化肝組織中circFBXW4的水平下調（圖2I-J）。總之，這些結果揭示了HF進展中circFBXW4的下調，而HF恢復中circFBXW4的表達恢復（圖2H）。 表明circFBXW4的表達與HF病理相關，并且circFBXW4可作為HF的診斷和預后標志物。

                                    圖2 CircFBXW4的表達在HF的小鼠中下降，在HF恢復的小鼠體內表達恢復
3、CircFBXW4的表征
    circFBXW4來源于宿主基因FBXW4，定位于19號染色體，包含4個外顯子，實驗證實其頭尾連接位點，且不可被Rnase R消化，核定位顯示主要分布于細胞質中（圖3）。

                                                 圖3 CircFBXW4的表征
4、circFBXW4在體外抑制LX-2細胞的活化和增殖
    過表達circFBXW4降低了FBXW4，TGF-β1，TIMP-1，α-SMA和collagens I的mRNA水平以及α-SMA和collagens I的蛋白水平（圖4A-B），并抑制了LX-2細胞的活化，細胞增殖，DNA合成和凋亡（圖4C-G）。

                                       圖4 LK-2細胞中過表達circFBXW4對其活性，增殖和凋亡的影響
5、circFBXW4對HF小鼠的抗纖維化作用
    施用熒光素酶標記的pHBAAV-circFBXW4后，HF小鼠的肝實質和血管結構畸變，膠原蛋白沉積和α-SMA+成纖維細胞免疫信號持續降低（圖5C），這與HSC中α-SMA和膠原蛋白I的表達降低有關（圖5D）；此外，肝組織中的羥脯氨酸（HYP）水平和血清中的丙氨酸轉氨酶（ALT）均降低（圖5E-F）。此外，circFBXW4過表達后，纖維化因子（TGF-β1，α-SMA，膠原蛋白I和TIMP-1）下調（圖5G）。
    綜上這些結果表明，通過遞送肝特異性pHBAAV-circFBXW4，在具有FBFBXW4過表達的HF小鼠中，肝纖維化損傷和肝纖維化標志物的表達被顯著抑制。

                                             圖5 HF小鼠體內circFBXW4的抗纖維化效果
6、circFBXW4在體內可預防HF小鼠的炎癥反應
    炎癥反應對HSCs激活和HF的啟動具有重要作用，因此，評估了circFBXW4在肝纖維化中對炎癥反應的功能。與媒介物相比，HF小鼠的肝巨噬細胞中circFBXW4的水平變化可忽略不計，并且在施用pHBAAV-circFBXW4后，肝巨噬細胞中circFBXW4的水平顯著升高（圖6A-B）。在circFBXW4過表達后，促炎性細胞因子TNF-α和IL-1β的循環水平降低了（圖6C）。此外，C-C基序趨化因子配體2（CCL2）和CCL9的mRNA水平在用pHBAAV-circFBXW4處理的肝巨噬細胞中得到抑制（圖6D）。
    作者使用炎癥抗體進一步測試了40種炎癥因子在小鼠肝組織裂解物中的表達數組。結果顯示，與媒介組相比HF小鼠的五種炎性因子的水平有所增加，而circFBXW4過表達后水平又下降了（圖6E）。另外，在遞送pHBAAV-circFBXW4后，肝臟組織中F4 / 80的免疫染色持續降低，HF小鼠中F4 / 80 + CD11b +肝巨噬細胞（肝巨噬細胞和浸潤性單核細胞）也持續下降（圖6F-G）。

                                              圖6 HF小鼠體內circFBXW4的抗炎性
7、微陣列分析和鑒定circFBXW4-miR-18b-3p的相關性
    鑒于circRNA吸附miRNA的特性，使用微陣列分析了HSCs細胞中的miRNA表達譜，共檢測到1881個差異表達的miRNA，其中132個miRNA在HF組和媒介組間差異表達，160個在HF組和HF恢復組間差異表達。其中有41個被預測為circFBXW4潛在靶標。
    螢光素酶結果顯示與對照相比，circFBXW4-wt熒光素酶活性在6種miRNA組中顯著抑制（圖7D）。隨后，RNA下拉檢測表明miR-18b-3p，miR-324-3p和miR-18b-5p可能直接與circFBXW4結合（圖7E），并在circFBXW4中鑒定到miR-18b-3p的結合位點序列（圖7F），circFBXW4和miR-18b-3p主要共定位在細胞質中（圖7G）。此外，與載體相比，HF小鼠中miR-18b-3p的水平顯著增加（圖7H）。 有趣的是，施用pHBAAV-circFBXW4后，肝纖維化中更高水平的miR-18b-3p被抑制。因此，circFBXW4可能直接充當miR-18b-3p的海綿，調節HF中miR-18b-3p的水平（圖7H）。因此，重點放在circFBXW4與miR-18b-3p之間的相互作用上，進行進一步研究。

                                           圖7 HSC和circFBXW4結合miR-18b-3p的微陣列分析
8、circFBXW4通過海綿吸附miR-18b-3p上調FBXW4的表達
    為了挖掘與HF相關的circFBXW4/miR-18b-3p的靶基因，進行了全轉錄測序，獲得差異表達的mRNA（DEM），對DEM進行GO和KEGG富集分析（圖8A-D）。分析發現FBXW7是miR-18b-3p的一個潛在靶基因，其結合序列如圖8E所示。此外，作者發現，HF小鼠中無論是CCl4誘導還是BDL處理FBXW7的表達始終下調。
    進一步揭示，circFBXW4通過海綿吸附miR-18b-3p調節FBXW7發揮抗纖維化作用，但是，miR-18b-3p水平上調后，pHBAAVcircFBXW4處理對FBXW7的作用被逆轉（圖8G-I）。相反，FBXW7的下游Yap1與指定的治療相反（圖8G-I）。這些結果表明circFBXW4充當了miR-18b-3p的海綿通過circFBXW4 / miR-18b-3p / FBXW7軸消除對HF的影響。

                                            圖8 circFBXW4/miR-18b-3p/FBXW7軸的鑒定
    總之，這篇研究揭示了HF中的circFBXW4 / miR-18b-3p / FBXW7形成的新型調控軸。研究了circFBXW4在HF中的表達模式，功能和機制，證實了在HF消退階段挽救了circFBXW4的表達，但該機制尚未明確闡明，需要進一步驗證。此外，circFBXW4提供了一個平臺，可容納各種與肝臟或纖維化相關的miRNA候選基因，但circFBXW4在ceRNA機制中的參與機制仍需解決。
參考文獻：
Chen Xin., Li Hai-Di., Bu Fang-Tian., Li Xiao-Feng., Chen Yu., Zhu Sai., Wang Jia-Nan., Chen Si-Yu., Sun Ying-Yin., Pan Xue-Yin., Yin Na-Na., Xu Jie-Jie., Huang Cheng., Li Jun.(2020). Circular RNA circFBXW4 suppresses hepatic fibrosis via targeting the miR-18b-3p/FBXW7 axis. Theranostics, 10(11), 4851-4870. doi:10.7150/thno.42423