m6A是mRNA中一種豐富的核苷酸修飾物，它可以調節mRNA的穩定性、剪接和翻譯，但它是否在腫瘤內微環境和腫瘤耐藥中也有生理作用尚不清楚。因此小編為大家帶來發表于“The EMBO Journal”的文章“RNA m6A methylation regulates sorafenib resistance in liver cancer through FOXO3-mediated autophagy”，讓大家了解m6A甲基化調節肝癌索拉非尼耐藥的機制。

結 果：
1.在索拉非尼耐藥的肝細胞癌中METTL3下調
    為了探討索拉非尼耐藥在肝癌中的分子機制，我們從長期接受索拉非尼治療的患者中獲得了索拉非尼耐藥的肝腫瘤，并進行轉錄組測序。我們發現索拉非尼耐藥肝腫瘤中819個基因顯著上調，775個基因顯著下調。利用KOBAS進行的基因富集分析發現了與耐藥性有關的幾種信號通路的失調，包括細胞對化學刺激的反應、對有機物的反應和對氮化合物的反應（圖1A）。在這四條信號通路中有13個基因重疊（圖1B）。我們發現METTL3在索拉非尼耐藥肝癌中顯著下調（圖1C）。通過RT-PCR進一步驗證了METTL3在索拉非尼耐藥的肝腫瘤中的下調作用（圖1D）。通過分析TCGA數據庫中肝癌的病理分期圖，我們發現METTL3的表達水平在肝癌的晚期顯著下調（圖1E）。這些結果表明METTL3的下調可能與HCC中的索拉非尼耐藥有關。
    為了證實METTL3在索拉非尼耐藥中的作用，我們系統地分析了GSE62813數據庫中METTL3在HepG-2細胞和索拉非尼耐藥的HepG-2細胞中表達的變化。我們發現METTL3在索拉非尼耐藥肝癌細胞中顯著下調（圖1F）。通過與原始 HepG-2細胞的比較，我們證實了這些HepG2細胞對索拉非尼的獲得性耐藥（圖1G）。另外，我們發現METTL3在抗索拉非尼的 HepG-2細胞中顯著降低，總RNA m6A水平持續下降（圖1H和I），表明METTL3在肝癌細胞中介導抗索拉非尼的潛在作用。

2.METTL3基因敲除增強肝癌中索拉非尼耐藥
    為了評估整體m6A水平是否與肝癌的發生有關，我們在正常肝細胞系WRL68中產生了一系列不同表達水平的METTL3。正常肝細胞在METTL3沉默后形成一個擴大的集落，但在METTL3過表達后沒有明顯變化（圖2A和B）。METTL3敲除后SMMC-7721、Bel-7402和HepG-2細胞對索拉非尼治療的敏感性的增加（圖2C和D）。此外，為了確定m6A在肝癌索拉非尼耐藥中的作用，我們進行了挽救實驗（圖2E和F）。我們的結果表明，挽救抗shRNA野生型METTL3會使METTL3敲除肝癌細胞和抗索拉非尼HepG-2細胞對索拉非尼治療敏感（圖2G-J），提示METTL3介導的m6A修飾在肝癌索拉非尼耐藥中的重要作用。
    為了進一步確定METTL3是如何控制肝癌中索拉非尼耐藥的，我們測定了METTL3對人臍靜脈內皮細胞成管能力的影響。結果顯示，與對照組相比，METTL3基因敲除組的肝癌細胞產生的腫瘤條件培養基顯示出更強的HUVEC管形成的能力(圖2K和K-1)。此外，METTL3基因敲除可上調缺氧條件下肝癌細胞中FGF、PDGF-B、STAT3和VEGF-A等血管生成標志物的RNA表達（圖2L和M）。Western blot進一步證實了VEGF-A和PDGF-B的誘導蛋白水平（圖2N和O）。綜上所述，我們的結果表明METTL3缺失增強了肝癌中的索拉非尼耐藥性。

3.METTL3依賴的索拉非尼在肝癌中的耐藥是通過促進肝癌的自噬介導的
    先前的報告顯示，自噬與人類癌癥的化療抵抗有關。為探討m6A調節是否參與自噬介導肝癌細胞對索拉非尼耐藥，采用透射電鏡觀察了缺氧條件下含或不含METTL3耗竭的SMMC-7721細胞的形態學變化。我們的結果表明，METTL3基因敲除增加了自噬體的數量（圖3A）。為了進一步證實這一現象，我們測量了自噬中的生物標志物LC3的脂質水平。結果表明，METTL3基因敲除顯著增加了肝癌細胞系中LC3-II的積累（圖3B-D）。抗索拉非尼的HepG-2細胞中LC3-II的積累也增強，與親本細胞相比，其METTL3的表達相對較低（圖3E）。值得注意的是，我們通過熒光免疫染色檢測到GFP-LC3在METTL3基因敲除的肝癌細胞和索拉非尼耐藥的HepG-2細胞中的亞細胞重新分布增加。挽救野生型METTL3減少了GFP-LC3在這些細胞中的積累（圖3F-H）。為了探討自噬在METTL3缺失引起的索拉非尼耐藥中的作用，我們測定了IC50。3-MA治療降低了METTL3基因敲除介導的LC3-II積累（圖3I-K），并使3-MA治療組索拉非尼的IC50顯著降低（圖3L-N）。這些結果表明METTL3的缺失增加了索拉非尼的自噬通量。

4.METTL3通過介導FOXO3信號調節肝癌細胞自噬
    我們探討了METTL3缺失激活肝癌自噬的機制。基因集富集分析揭示了細胞對逆境基因反應途徑的富集。GSEA中富集了23個有顯著變化的基因（圖4A）。KEGG分析表明，FOXO3是一種普遍的轉錄因子，當METTL3敲低時，其自噬信號途徑發生了顯著變化（圖4B）。為了確定METTL3如何調控肝癌中的FOXO3，我們首先檢測了METTL3基因敲除后FOXO3的表達水平。我們證實在穩定的METTL3敲除細胞中，FOXO3在蛋白質和RNA水平上顯著下調（圖4C）。此外，經ActinomycinD和Cycloheximide處理后，METTL3基因敲除細胞中FOXO3 mRNA的半衰期和蛋白水平較對照細胞顯著降低（圖4D和E）。通過RNA組分離，我們發現METTL3敲除顯著降低了FOXO3在40S組分下的翻譯效率（圖4F）。接下來，為了確定調節FOXO3表達水平的潛在m6A讀取器，我們在Bel-7402細胞中敲除了YTHDF1和YTHDF2（圖4G）。敲除YTHDF1消除了METTL3過表達Bel-7402細胞中FOXO3蛋白水平的升高（圖4H）。反過來，YTHDF1的缺失顯著降低了FOXO3的RNA表達水平（圖4I），表明YTHDF1可能通過m6A修飾參與了FOXO3表達的調控。
    為了證明m6A調控對YTHDF1介導的FOXO3表達的影響，我們將FOXO3 3’UTR克隆到一個雙熒光素酶報告子結構中，產生FOXO3 3’UTR的突變形式（圖4K）。在不同濃度METTL3的Bel-7402細胞中測定了野生型和突變型FOXO3 3’UTR的相對標準化熒光素酶活性。在METTL3敲除和YTHDF1敲除細胞中檢測到野生型FOXO3的熒光素酶活性降低。相反，對于FOXO3的3’UTR突變形式，METTL3或YTHDF1的缺失沒有任何影響（圖4L）。在METTL3過表達的細胞中，YTHDF1的缺失消除了野生型FOXO3對熒光素酶活性的誘導（圖4L）。此外，為了驗證FOXO3作為缺氧條件下METTL3介導的m6A修飾的真實靶點，我們進行了m6A RNA免疫沉淀分析（MeRIP）和YTHDF1-RIP分析，并通過RT-PCR進行了分析。METTL3的敲除顯著降低了FOXO3 mRNA的m6A水平（圖4M），并降低了YTHDF1與FOXO3 mRNA的結合（圖4N）。此外，通過對肝腫瘤數據集的分析，我們發現在mRNA水平上，YTHDF1與FOXO3（圖4O）和METTL3與FOXO3（圖4P）呈顯著正相關。總之，我們證實FOXO3是METTL3介導的肝癌m6A修飾的關鍵靶點。

5.過表達FOXO3通過抑制自噬挽救肝癌m6A依賴性索拉非尼敏感性
    為了研究FOXO3在自噬信號途徑中直接靶點之間的連接性，我們分析了兩個數據庫，其中FOXO3由強力霉素誘導。FOXO3在自噬中的過表達下調了基因表達譜，而在SMMC-7721細胞中，FOXO3的敲除誘導了自噬相關基因的轉錄（圖5A）。與METTL3的下調一致，FOXO3在索拉非尼耐藥的HepG-2細胞中顯著下調（圖5B）。敲除FOXO3可提高肝癌細胞系的自噬活性（圖5C）。為了確定FOXO3是否在METTL3依賴性自噬中起關鍵作用，我們過表達FOXO3。結果表明，FOXO3在METTL3基因敲除細胞中的過表達降低了自噬活性（圖5E），減少了自噬體的數量（圖5F），并延緩了GFP-LC3的亞細胞再分布（圖5G）。同樣，在索拉非尼耐藥的HepG-2細胞中過表達FOXO3的熒光免疫染色顯示相同結果（圖5H）。我們還發現，FOXO3的過表達顯著影響了m6A介導的耐藥肝癌細胞對索拉非尼的治療（圖5I-L）。綜上所述，這些結果表明FOXO3在肝癌中METTL3耗竭介導的索拉非尼耐藥中起著關鍵作用。

6.體內METTL3缺失通過METTL3/FOXO3軸顯著增強索拉非尼抗性
    為了驗證METTL3在肝癌進展中介導索拉非尼耐藥中的作用，我們建立了同種異體移植小鼠模型，并給藥：DMSO和索拉非尼（50 mg/kg/2天，腹腔注射）。與我們之前的體外實驗結果一致，隨著腫瘤大小和腫瘤重量的增加，METTL3基因敲除顯著地消除了索拉非尼體內治療的抑制作用（圖6A-C）。此外，我們將Bel-7402細胞直接注射到NOD-SCID小鼠的肝實質中，建立了原位移植性肝癌模型。與對照組相比，METTL3基因敲除消除了索拉非尼對肝腫瘤微環境的抑瘤作用（圖6D和E）。為了進一步證實METTL3/FOXO3軸在體內肝癌中的作用，我們構建了同種異體移植小鼠模型，并像以前一樣開始給藥。一致地，METTL3的敲除顯著地消除了索拉非尼在體內的抑制作用。值得注意的是，在METTL3敲除的Hepa1-6細胞中過表達FOXO3挽救了索拉非尼敏感性效應，這反映在與溶劑治療組相比，腫瘤大小和腫瘤重量顯著減少（圖6F-H）。與單獨使用METTL3相比，在索拉非尼治療的METTL3敲除的細胞中過表達FOXO3顯示出增殖、自噬和血管生成減少（圖6I-L）。
    此外，我們在BALB/C裸鼠中建立了兩個肝癌患者來源的異種移植（PDX）模型，并用四種方案給藥（圖7A）。與索拉非尼治療對照組（圖7B-D和I）相比，METTL3損耗顯著地挽救了異種移植瘤的生長，后者分別表現為Ki67（圖7F）、LC3-B（圖7G）和VEGF-A（圖7H）所示的增殖、自噬和血管生成增加（圖7E）。綜上所述，我們得出結論：體內METTL3缺失主要通過METTL3/FOXO3軸顯著增強索拉非尼抗性。

結 論：
    我們的工作揭示了METTL3介導的m6A修飾在缺氧腫瘤微環境中的關鍵作用，并確定FOXO3是m6A修飾在肝癌抗索拉非尼治療中的重要靶點。