膽管癌（CCA）是一種上皮惡性腫瘤，其5年生存率極低。其中90％以上的CCA來自肝外膽管，容易形成惡性膽道梗阻。手術切除肝外CCA（ECCA）的復發率仍然很高，目前的標準化學療法或放射療法并未提高生存率。目前，膽道引流已成為不可切除患者的標準治療方法。這種治療可以使膽紅素水平正常化，從而提高整體生存率。然而，由于諸如支架遷移、支架阻塞，腫瘤向內生長、感染和膽管炎等并發癥，長期膽道引流仍然具有挑戰性。基于治療ECCA的這些困難，研究治療策略至關重要。2020年7月6日，來自中國醫學科學院黃波、劉玉英、天津醫科大學王西墨等人合作在Nature Biomedical Engineering雜志上發表了一篇文章“Methotrexate-loaded tumour-cell-derived microvesicles can relieve biliary obstruction in patients with extrahepatic cholangiocarcinoma.”（影響因子18.952），該研究報道了甲氨蝶呤負載的腫瘤細胞微泡可緩解肝外膽管癌患者的膽道梗阻。

結 果:
一、MTX–TMP灌注可有效治療阻塞性CCA
        首先對患有惡性膽道梗阻的晚期ECCA（n = 20）患者進行經皮肝穿刺膽道引流術（PTBD），然后將負載甲氨蝶呤（MTX）的TMP（MTX–TMPs）（20ml含有6×107 MPs和120μgMTX）注入腫瘤上方的膽管腔質量，然后關閉2小時的管，這使MTX–TMP發揮作用。然后，作者打開導管并收集膽道引流。根據糞便顏色的變化，膽管造影顯示20例患者中有5例梗阻得到緩解（圖1a）。此外，在治療后，阻塞緩解可能會持續較長時間。例如，一名患者接受MTX-TMP治療后，膽管梗阻可緩解長達5個月（圖1b）。這些結果表明，MTX-TMPs可用于治療患有膽道梗阻的ECCA患者。

二、MTX–TMP灌注吸引中性粒細胞
        接下來，作者研究了MTX-TMP灌注治療阻塞性CCA的潛在機制。HE染色顯示腫瘤周圍細胞外基質和基底膜的密度很高（圖2a）。重點是，腫瘤組織可以被膠原酶溶解，導致CD45-腫瘤細胞的釋放。但是，TMP或MTX-TMP與腫瘤組織的孵育沒有相似的效果（圖2b），這表明TMP本身可能不會直接降解基質。因此，可能會響應MTX-TMPs釋放特定因子，這可能會破壞基質結構并允許TMP獲得進入CCA細胞的通道。對膽汁引流年齡的流式細胞儀分析表明，治療前CCA患者的膽汁中存在少量免疫細胞，但是MTX-TMP灌注顯著增加了膽管中免疫細胞的數量（圖2c）。大多數其他免疫細胞是嗜中性粒細胞，有一些巨噬細胞，但很少有T細胞，B細胞或其他免疫細胞（圖2d，e）。值得注意的是，在引流（圖2f，g）中檢測到了中性粒細胞相關的組織降解酶彈性蛋白酶和基質金屬蛋白酶8（MMP8）。這些酶在引流中的水平與其他中性粒細胞的數量呈正相關（圖2h，i）。這些結果表明，MTX-TMP灌注有效地將中性粒細胞募集到膽汁中，在那里它們釋放彈性蛋白酶和MMP8，從而削弱了基質屏障并允許MTX-TMP獲得進入CCA細胞的通道。

三、中性粒細胞被MTX–TMP中的UDPG和C5直接吸引
        接下來，作者研究了中性粒細胞在MTX–TMP灌注過程中如何被膽汁吸引。Transwell測定發現MTX–TMP能夠吸引中性粒細胞從上腔室遷移至下腔室（圖3a，b），這表明MTX–TMPs能夠募集中性粒細胞。當UDPG注入UDPG時引起中性粒細胞積累小鼠腹膜腔（圖3d，e）。 Transwell分析還顯示UDPG吸引了中性粒細胞（補充圖3g）。在TMP，MTX–TMP或其他藥物–TMP中無法檢測到UTP水平。因此，增加的UDPG可能不是由于MTX治療的HL-60腫瘤細胞中UTP增加。作者觀察到，MTX處理顯著上調了參與糖原合成的酶的表達，導致HL中糖原和UDPG的水平增加-60個細胞（圖3f）。來自UGP2-/-HL-60細胞的MTX-TMPs中性粒細胞吸引力顯著降低（圖3i），這表明UDPG的存在使中性粒細胞被MTX-TMP吸引。  C5a是一種ana phylatoxin，可以吸引粒細胞。與其他藥物相比，MTX處理可顯著增加HL-60細胞和衍生的TMP中C5的表達（圖3j）。C5組合式減弱了MTX-TMP介導的中性粒細胞吸引力（圖3k）。作者還發現，源自C5或UDPG缺陷的HL-60細胞的MTX–TMPs幾乎完全喪失了吸引中性粒細胞的能力（圖3k），這表明中性粒細胞的吸引力是依賴的在C5和UDPG上。重要的是，在MTX-TMP灌注后，作者觀察到患者膽汁引流中UDPG和C5濃度增加（圖3l）。總之，MTX-TMP灌注能夠通過UDPG和C5依賴性途徑吸引嗜中性粒細胞。

四、MTX–TMPs誘導CCA細胞凋亡
        流式細胞儀和H＆E染色分析了五名患者的引流膽汁中的腫瘤細胞，作者發現MTX–TMP灌注以時間依賴性方式導致CD45?腫瘤細胞死亡（圖4a）。灌注之前，約有1.8％的CD45-腫瘤細胞死亡。然而，治療后，死亡的腫瘤細胞的平均比例分別在4h后增加到9％，在24h和48h之后分別增加到20％和25％（圖4a）。為了驗證MTX–TMP殺死CCA細胞的能力，作者在體外將MTX–TMP與CCA細胞一起孵育。結果表明，只有MTX–TMP，而不是單獨使用藥物或不含藥物的TMP，對腫瘤細胞具有細胞毒性作用（圖4b，c）。MTX-TMP介導的細胞毒性似乎誘導了壞死樣的形態改變，這是由垂死的細胞與質膜上的特征性大氣泡腫脹所證實的（圖4c）。大量的胞質成分乳酸脫氫酶（LDH）被釋放到上清液中（圖4d），表明程序性壞死細胞死亡。蛋白質印跡分析表明，MTX-TMP處理的人RBE CCA細胞均未激活MLKL和GSDMD。然而，GSDME被顯著激活（圖4e）。更重要的是，發現從PDX小鼠模型中分離出的人類原代CCA細胞表達高水平的GSDME，MTX-TMP處理導致活性GSDME的產生（圖4g）。與CCA細胞凋亡一致，作者還發現5例患者在MTX–TMP灌注后引流中LDH水平升高（圖4h）。總之，通過GSDME途徑進入腫瘤的MTX-TMP觸發了CCA細胞的熱凋亡。

五、MTX–TMP灌注觸發了第二次招募中性粒細胞的浪潮
        作者假設，MTX-TMP介導的焦細胞凋亡觸發了中性粒細胞向膽管遷移的第二波。經驗證發現，來自焦光CCA細胞的上清液可以有效吸引中性粒細胞（圖5a）。并且用焦磷酸化CCA細胞上清液處理的巨噬細胞不僅上調了IL-6和CCL2，而且還產生了嗜中性粒細胞引誘劑腫瘤壞死因子（TNF），IL-1β，CCL3，CCL20和CXCL5（圖5b）。巨噬細胞的上清液能夠有效地吸引嗜中性粒細胞（圖5c），這表明經熱解刺激的巨噬細胞具有吸引中性粒細胞的能力。MTX–TMP處理過的人類單核細胞衍生的巨噬細胞還產生了多種細胞因子，例如IL-6，CCL2，CCL3，CCL20和中性粒細胞引誘劑CXCL1，CXCL5和TNF（圖5d）。此外，兩種吸引巨噬細胞的化學因子CCL2和CCL3以及一種天然的吸引T細胞的趨化因子CCL20在引流中也升高了（圖5e）。總之，在MTX-TMP灌注后，UDPG對中性粒細胞產生了最初的吸引力之后，出現了第二次中性粒細胞募集的浪潮。

六、MTX–TMP灌注誘導的中性粒細胞顯示出抗腫瘤表型
        為了闡明募集的中性粒細胞在膽管中的作用，作者從患者中分離了中性粒細胞，并將其與CCA細胞孵育。作者發現這些中性粒細胞具有殺死腫瘤細胞的能力（圖6a）。在MTX-TMP灌注后，膽汁中性粒細胞和膽汁引流年齡發現活性氧ROS和NO水平升高（圖6b，c）。作者檢查了MTX-TMP對嗜中性粒細胞的作用，發現處理過的細胞具有殺死CCA細胞的能力（圖6d），同時伴隨著ROS水平的升高（圖6e）。此外，作者發現，MTX-TMP處理過的RBE細胞的焦上清液還賦予嗜中性粒細胞殺死CCA細胞的能力，并增加了ROS水平（圖6f，g）。總之，MTX-TMP灌注觸發了多種途徑，這些途徑將膽汁浸潤性中性粒細胞引導至抗腫瘤表型。

結 論:
        這項研究的結果表明，含有MTX的MTP通過動員和激活中性粒細胞，可以作為一種免疫治療劑，有效治療阻塞性ECCA。 與不攻擊腫瘤細胞的常規靶向嗜中性白細胞的免疫治療劑（例如Coley毒素和卡介苗桿菌Calmette-Guérin免疫療法）不同，MTX-TMP也能夠直接殺死腫瘤細胞。 更重要的是，這種殺傷作用可誘導腫瘤細胞發生熱解性死亡，從而產生強烈的炎癥信號，從而壓倒腫瘤的威壓并賦予腫瘤浸潤性嗜中性粒細胞以抗腫瘤表型。