在全球所有惡性腫瘤中，非小細胞肺癌(NSCLC)的死亡率最高。 lncRNA在腫瘤進展中的作用是當前的研究熱點。基于TCGA數據庫的綜合分析，我們發現RMRP是與NSCLC低生存率相關的最高上調的lncRNA之一。此外，m6A在RMRP內高度富集，增強了其RNA穩定性。體外和體內實驗表明，RMRP可促進NSCLC細胞增殖、侵襲和遷移。在機制上，RMRP將YBX1招募到TGFBR1啟動子區域，導致TGFBR1的轉錄上調。TGFBR1/SMAD2/SMAD3通路也受RMRP調控。此外，RMRP促進了腫瘤干細胞特性和上皮間充質轉化，從而促進了對放療和順鉑的耐藥。臨床資料進一步證實RMRP與TGFBR1呈正相關。我們的工作揭示了m6A RNA甲基化介導的RMRP穩定性通過調控TGFBR1/SMAD2/SMAD3通路而導致NSCLC的增殖和進展。本文于2021年10月發表在“Cell Death & Differentiation”（ IF:15.828）期刊上。

技術路線

結果

1）NSCLC的綜合分析顯示RMRP可能是一種生物標志物

我們對TCGA肺腺癌(LUAD)數據庫進行了綜合分析。與正常組織相比，RMRP在非小細胞肺癌組織中上調(圖1A)。高RMRP表達與晚期T期和較差的生存率相關(圖1B和C)。此外，在GSE43458中，與正常肺組織相比，非小細胞肺癌組織中RMRP表達上調，如圖GEO數據庫(圖1D)所示。GO結果顯示，RMRP在蛋白質異二聚活性、染色質DNA結合、苦味受體活性等方面發揮作用(圖1E)。KEGG結果顯示RMRP在酒精中毒、系統性紅斑狼瘡、病毒癌變、轉錄異常等途徑富集(圖1F)。然后進行KEGG研究的基因集富集分析(GSEA)。RMRP在細胞周期、結直腸癌、蛋白質輸出、TGFB途徑和泛素介導的蛋白水解途徑中富集(圖1G)。這些通路與腫瘤的發生和轉移密切相關，提示RMRP可能在NSCLC中發揮重要作用。我們還對RMRP的蛋白編碼潛能進行了探究，發現RMRP不具有蛋白編碼潛能(圖1H和I)。

2）m6A修飾在RMRP中富集，提高了RMRP的轉錄穩定性

最近的初步研究報道，m6A修飾廣泛存在，通過調控轉錄組影響RNA的剪接、翻譯、輸出、定位和穩定性。為了探究m6A對RMRP的修飾，我們首先使用在線生物信息學工具m6Avar預測位于RMRP中的m6A位點，并鑒定出兩個RMRP m6A序列基元。然后，在人肺上皮細胞(HBE)和兩株NSCLC細胞株(A549和H1299)中進行甲基化RNA免疫沉淀(Me-RIP)檢測。MeRIP-qPCR檢測顯示，HBE細胞中RMRP的m6A甲基化水平低于NSCLC細胞(A549和H1299)(圖2A)。然后我們用小干擾RNA靶向m6A甲基化酶復合物的核心成分METTTL3，發現A549細胞中總RNA和RMRP RNA中的m6A水平都降低了(圖2B, C, D)。放線菌素D 阻斷A549細胞新RNA合成后，檢測RMRP RNA的丟失情況。結果顯示，METTL3下調后，RMRP表現出較低的RNA穩定性(圖2E)。

3）RMRP促進NSCLC細胞增殖

為了進一步探討RMRP的作用，我們采用定量RT-PCR方法檢測RMRP在NSCLC細胞中的表達。RMRP在A549細胞中的表達明顯高于H1299細胞(圖3A)。因此，我們在A549細胞中轉染了兩種不同的抗RMRP shRNA (shRMRP-1和shRMRP-2)或對照組的shRNA (rash)，并在H1299細胞中轉染了RMRP過表達質粒(RMRP)或對照的質粒。通過定量RT-PCR分析證實了轉染效率(圖3B和C)。CCK-8和菌落形成實驗表明，轉染了shRMRP的NSCLC細胞的生長和增殖受到了顯著的抑制。而轉染過表達RMRP的質粒后效果相反(圖3D-G)。

4）TGFBR1是RMRP促進增殖、侵襲和遷移的關鍵靶點

在我們之前的研究中，我們發現TGFBR1與NSCLC的增殖和轉移相關，GSEA結果顯示RMRP可能參與了TGFB通路。TCGA數據庫顯示TGFBR1與RMRP表達呈正相關(圖4A)。因此，我們假設RMRP可能以TGFBR1為靶點。此外，在A549或H1299細胞中，RMRP敲低或過表達后，TGFBR1的表達發生改變(圖4B、C、D)。在A549細胞中，下調RMRP后，TGFBR1的表達降低，BAX/ Bcl-2升高，而TGFBR1過表達后，效果相反。在H1299細胞中，過表達RMRP后，TGFBR1的表達增加，BAX/Bcl-2的表達減少，而TGFBR1敲低后則相反(圖4D)。此外，我們還探索了TGFBR1參與RMRP促進NSCLC生長和增殖的機制。結果顯示，TGFBR1過表達后，shRMRP對NSCLC細胞生長和增殖的抑制作用得到恢復，而TGFBR1敲低后則相反(圖4E, F, H, J)。

TGFBR1促進NSCLC細胞的侵襲、遷移和G1細胞周期進展。因此，我們探討了RMRP對侵襲、遷移和G1細胞周期進程的影響。與對照組相比，轉染shRMRP的NSCLC細胞顯著抑制了侵襲、遷移和G1細胞周期進展，而在RMRP過表達的細胞中觀察到相反的效果。在TGFBR1過表達后，，shRMRP對NSCLC細胞的侵襲、遷移和G1細胞周期進展的抑制作用被挽救，而在TGFBR1敲低后，觀察到相反的效果(圖4G, I, K, L, M，和N)。以上結果表明TGFBR1可能是RMRP促進增殖、侵襲和遷移的關鍵靶點。

5）RMRP與轉錄因子YBX1相關

為了進一步闡明RMRP的機制，我們在NSCLC細胞中進行了核和細胞質RNA的分離和熒光原位雜交(FISH)檢測。結果顯示，RMRP主要位于胞質(圖5A和B)。最近的一些報道發現，許多lncRNA通過與DNA或蛋白質相互作用發揮作用。為了探討RMRP的調控作用，我們使用catRAPID。結果顯示，在NSCLC中發揮重要作用的YBX1是RMRP的潛在結合蛋白(圖5C)。RIP實驗顯示，抗YBX1抗體顯著富集了RMRP(圖5D和E)。RNA下拉實驗進一步證實了RMRP和YBX1之間的相互作用(圖5F)。以上結果表明YBX1與RMRP之間存在密切的相互作用。

6）RMRP通過招募YBX1來促進TGFBR1的轉錄

我們探索TCGA-LUAD的ATAC-seq數據，以確定TGFBR1可能的轉錄因子。該分析揭示了TGFBR1基因啟動子區可能存在的YBX1結合序列。在GEPIA的TCGA-LUAD數據庫中，YBX1的表達與TGFBR1呈正相關，而與RMRP無相關性(圖6A-C)。因此，我們推測YBX1是一個轉錄因子，可能被RMRP招募到TGFBR1啟動子中。為了進一步研究其機制，我們分別轉染siRNA (SiYBX1)、pcDNAYBX1 (YBX1)和它們匹配的對照(SiNC或Ctrl)。YBX1敲低抑制了TGFBR1的表達，而YBX1過表達則增加了TGFBR1的表達(圖6D)。YBX1結合復合物顯示TGFBR1啟動子顯著富集。YBX1過表達增加了TGFBR1-WT細胞中的熒光素酶活性 (圖6G和H)。RMRP敲低降低了YBX1在TGFBR1啟動子上的富集。共轉染YBX1可逆轉這一效應(圖6I)。此外，RMRP增加了結合(圖6J)。熒光素酶檢測進一步顯示，熒光素酶活性的變化是由于RMRP的敲減或過表達(圖6K和L)。

7）RMRP調控NSCLC中TGFBR1/SMAD2/ SMAD3通路

TGFBR1/SMAD2/SMAD3通路在NSCLC中發揮重要作用。Western blot和免疫熒光檢測顯示，RMRP敲低顯著抑制了NSCLC細胞中的核易位和p-SMAD2/ 3的表達(圖7A和B)。RMRP的改變對siTGFBR1組中p-SMAD2和p-SMAD3的表達水平沒有影響，這表明TGFBR1是RMRP激活SMAD2/SMAD3信號通路所必需的(圖7C)。

TGFB通路常與CSC性質和EMT有關。因此，我們探討了RMRP是否促進NSCLC中的CSC特性。我們通過qRT-PCR檢測了CSC相關基因KLF4、SOX2、NANOG、CD133和ALDH的表達，發現在A549細胞中，RMRP敲低后這些基因的表達降低。在H1299細胞中，過表達RMRP后，這些基因表達上調(圖7D)。此外，我們還進一步探索了這些細胞中EMT相關基因的表達。結果顯示，RMRP敲低增加了E-Cadherin的表達，降低了N-Cadherin和Vimentin的表達(圖7A)。我們還探索了這些細胞的成球能力。實驗表明，RMRP敲低降低了成球能力，而過表達RMRP則增加了成球能力(圖7E)。RMRP抑制增加了A549細胞對順鉑和放療的敏感性(圖7F和G)。這些數據表明，RMRP通過增強CSC自我更新和EMT促進NSCLC進展。

8）在體內抑制RMRP抑制腫瘤生長

為了進一步證實RMRP在體內促進腫瘤生長，將A549-shRMRP細胞和A549- scramble細胞注射到裸鼠體內。30天后，shRMRP組腫瘤明顯變小(圖8A和B)。shRMRP組腫瘤體積和重量顯著降低（圖8C，D）。此外，在A549-scramble中，Ki-67、MMP9和TGFBR1的表達更高（圖8E）。

結論：m6A修飾促進了lncRNA-RMRP/TGFBR1/SMAD2/SMAD3通路。其潛在的機制是通過RMRP將轉錄因子YBX1招募到TGFBR1啟動子，從而對TGFBR1進行轉錄調控。此外，RMRP增加了球形成能力和EMT，這與放療和化療的耐藥有關。RMRP是一種生物標志物，在NSCLC中具有潛在的預后和治療相關性。

參考文獻：Yin H, Chen L, Piao S, Wang Y, Li Z, Lin Y, Tang X, Zhang H, Zhang H, Wang X. M6A RNA methylation-mediated RMRP stability renders proliferation and progression of non-small cell lung cancer through regulating TGFBR1/SMAD2/SMAD3 pathway. Cell Death Differ. 2021 Oct 9. doi: 10.1038/s41418-021-00888-8. Epub ahead of print. PMID: 34628486.