小核仁RNA宿主基因7 (small nucleolar RNA host gene 7，SNHG7) 的衍生lncRNA在包括肺腺癌（LUAD）在內的多種癌癥中已被廣泛報道。然而，lncRNA SNHG7是否參與LUAD的多西他賽耐藥尚不清楚。本文發現外泌體介導SNHG7的轉移增強了肺腺癌的多西他賽耐藥。本文于2021年10月發表在《Cancer Letter》IF：8.679雜志上。

技術路線：

主要實驗結果：

1、SNHG7增強LUAD細胞對多西他賽的抗性

首先檢測SNHG7是否和LUAD細胞抵抗多西他賽有關，結果顯示與相應的親代細胞相比，SNHG7在多西他賽耐藥的LUAD細胞系（H1299/DTX and SPC-A1/DTX）中高表達（圖1A）。敲除SNHG7后，H1299/DTX and SPC-A1/DTX對多西他賽的耐藥性顯著降低（圖1B-C），表明SNHG7增強LUAD細胞對多西他賽的抗性。此外，SNHG7在耐藥細胞和相應的親代細胞中都主要分布于細胞質中，表明其增強耐藥性是通過轉錄后調控。

圖1 SNHG7增強LUAD細胞對多西他賽的抗性

2、SNHG7增強LUAD細胞的多西他賽抗性，誘導巨噬細胞M2極化

為了研究SNHG7是否影響多西他賽對LUAD細胞的生物學功能，在有無多西他賽處理下進行功能實驗。如圖2A-C所示，陳曼SNHG7降低了0或100μg/L多西他賽暴露后的H1299/DTX and SPC-A1/DTX細胞的增殖，但增加了細胞凋亡。在小鼠體內，多西他賽抑制腫瘤生長，減小腫瘤體積和重量，而這種作用在SNHG7敲除后進一步被放大（圖2D-F）。因此，SNHG對多西他賽在LUAD細胞中的抗腫瘤作用有負面影響。

眾所周知M2極化的腫瘤相關巨噬細胞會促進腫瘤進展和化學抗性。所以作者想知道SNHG7是否會影響巨噬細胞M2極化。結果顯示IL-3處理巨噬細胞增加了M2標志物的表達，包括CD206和ARG1，但是敲除SNHG7會反轉這種趨勢（圖2G-H）。此外，IL-3處理增加了CD11b+CD206+標記的巨噬細胞比例，但敲除SNHG7會反轉這種作用（圖2I）。這些結果表明SNHG7正向調節巨噬細胞M2極化。

圖2 SNHG7增強LUAD細胞的多西他賽抗性，誘導巨噬細胞M2極化

3、SNHG7通過調節ATG5和ATG12誘導多西他賽耐藥的LUAD細胞自噬

自噬在調控腫瘤細胞耐藥中發揮著重要作用，所以作者猜測SNHG7可能通過自噬促進耐藥，于是檢測了敲除SNHG7后耐藥細胞H1299/DTX和SPC-A1/DTX中自噬相關基因的表達。如圖3A所示，WB表明敲除SNHG后暴露0或100μg/L多西他賽 H1299/DTX and SPC-A1/DTX細胞中LC3I/II, ATG5, ATG12的表達顯著降低，但不影響ATG7和ULK1；100μg/L多西他賽處理顯著降低了H1299/DTX and SPC-A1/DTX細胞中LC3-II/LC3-1, ATG5, ATG7, ATG12, and ULK1水平，但同時敲除SNHG7只增強了多西他賽導致的LC3I/II, ATG5, ATG12的表達降低作用。這表明SNHG7正調節自噬通過ATG5和ATG12。此外，免疫熒光顯示敲除SNHG7可以減少自噬小體和ATG5和ATG12蛋白水平，但是沒有改變其mRNA水平，并且熒光素酶實驗顯示SNHG7不能改變ATG5和ATG12的啟動子熒光素酶活性（圖3B-D），表明SNHG7不是在轉錄水平調控ATG5和ATG12。

圖3 SNHG7通過調節ATG5和ATG12誘導多西他賽耐藥LUAD細胞自噬

4、SNHG7招募HuR以穩定ATG5和ATG12從而影響LUAD細胞的增殖、凋亡和多西他賽耐藥

接下來，研究SNHG7如何調控ATG5和ATG12。首先進行RNA pulldown實驗獲得與antisense比較在，senseSNHG7中差異的蛋白條帶，然后用MS識別差異條帶，獲得與SNHG7相互作用的蛋白，結果發現CUL4A和HuR在senseSNHG7中顯著富集（圖4A-B）。RIP證實SNHG7可以被HuR抗體富集沉淀（圖4B-C）。RIP證明HuR和ATG5和ATG12有結合作用（圖4D-E），并且，敲除SNHG7減少了ATG5和ATG12和HuR的結合（圖4F）。此外，敲除SNHG7或HuR的表達都會顯著降低ATG5和ATG12的mRNA穩定性（圖4G-H）。以上結果表明SNHG7招募HuR以穩定ATG5和ATG12。

之后作者通過拯救實驗證明SNHG是通過 ATG5和ATG12影響LUAD細胞的增殖、凋亡和多西他賽耐藥性的（結果未展示）。

圖4 SNHG7招募HuR穩定ATG5和ATG12

5、多西他賽耐藥LUAD細胞分泌的外泌體SNHG促進LUAD的耐藥性和巨噬細胞M2極化

如圖5A-D所示，分離獲得了耐藥性LUAD細胞系H1299/DTX and SPC-A1/DTX的外泌體，隨后這些被PKH67標記的外泌體顯示分布在H1299/DTX and SPC-A1/DTX的細胞質中。之后，將這些外泌體和SNHG7敲除或未敲除的巨噬細胞共孵育。結果發現外泌體處理組M2標志物顯著上調，但是當同時敲除SNHG7后，這種上調作用被減弱（圖5E-F）。類似的，CD11b+CD206+巨噬細胞比例在外泌體處理組顯著上調，在SNHG7+外泌體組顯著回落（圖5G）。表明耐藥性LUAD細胞來源外泌體SNHG7促進LUAD細胞的耐藥性和巨噬細胞M2極化。

圖5來自多西他賽耐藥LUAD細胞的外泌體SNHG7促進LUAD細胞的多西他賽耐藥和巨噬細胞M2極化

6、SNHG7通過招募CUL4A增加PTEN泛素化水平，激活PI3K/AKT通路介導巨噬細胞M2極化

隨后探究SNHG7調控M2極化的機制。作者首先篩選了9條常見的信號通路，并進行熒光素酶實驗，發現只有PI3K/AKT信號通路的熒光素酶信號在SNHG敲除后顯著下降（圖6A）。隨后WB驗證表明敲除SNHG7會顯著抑制外泌體處理的巨噬細胞AKT的磷酸化，但對其mRNA的表達無影響（圖6B-C）。亞細胞定位也顯示外泌體處理的巨噬細胞中SNHG7主要定位與細胞質（圖6D）。之后過表達SNHG7的同時用蛋白合成抑制劑CHX處理外泌體孵育后的巨噬細胞，發現過表達SNHG7后PTEN蛋白穩定性下降，并且外泌體處理的巨噬細胞中PTEN的泛素化增加了，而MG132阻斷了這種SNHG過表達對PTEN泛素化的抑制作用（圖6E）。

此外，之前的MS鑒定到的CUL4A是一個泛素化相關蛋白。所以作者推測SNHG7可能通過招募CUL4A調控PTEN的泛素化。FISH-IF共染證明了CUL4A和SNHG7之間的共定位（圖6F），RIP和RNA pulldown證實了兩者間的結合關系（圖6G-H）。此外，co-IP實驗結果表明PTEN可以被CUL4A富集沉淀，而這種富集在過表達SNHG7之后顯著上調。以上表明SNHG7是通過招募CUL4A調控PTEN的泛素化。

圖6 SNHG7通過招募CUL4A促進PTEN泛素化激活PI3K/AKT通路

綜上所述，本研究表明外泌體SNHG7通過誘導LUAD細胞自噬和促進巨噬細胞M2極化促進LUAD細胞多西他賽耐藥。機制上，SNHG7招募HuR穩定ATG5和ATG12，誘導LUAD細胞自噬。同時，耐多西他賽的LUAD細胞分泌外泌體SNHG7，促進親代LUAD細胞耐多西他賽。此外，外泌體SNHG7通過招募CUL4A促進PTEN泛素化，激活PI3K/AKT通路，觸發巨噬細胞M2極化。

圖7 SNHG7誘導LUAD細胞多西他賽耐藥和巨噬細胞M2極化的分子機制

參考文獻：

Zhang Kai., Chen Jing., Li Chen., Yuan Yuan., Fang Surong., Liu Wenfei., Qian Yingying., Ma Jiyong., Chang Ligong., Chen Feifei., Yang Zhenhua., Gu Wei.(2021). Exosome-mediated transfer of SNHG7 enhances docetaxel resistance in lung adenocarcinoma. Cancer Lett, undefined (undefined), undefined. doi:10.1016/j.canlet.2021.10.029