頭頸部鱗狀細胞癌（HNSCC）是一種發生于口腔、咽和喉部的惡性腫瘤，其5年生存率大約只有50%，研究與腫瘤發生和轉移相關的潛在機制是發展HNSCC治療的關鍵。腫瘤干細胞（CSCs）具有無限的自我更新能力和腫瘤啟動能力，參與了HNSCC的腫瘤進展、治療耐藥性和復發，而靶向CSC相關通路的藥物是癌癥治療的顯著療法。目前，有研究發現褪黑素（Mel）和維替泊芬（VP）具有抗腫瘤作用，可調節線粒體自噬，減弱EMT和相關干細胞特性。該研究發表在《JOURNAL OF PINEAL RESEARCH》，IF:13.007。

技術路線：

主要研究結果：

1.   HNSCC CSCs在低ROS水平和腫瘤球體形成能力的細胞培養中富集

在許多類型的癌細胞中，ROS水平可用于豐富CSC群體，因為CSC居住在相對較低的ROS條件下，以維持靜止和自我更新。此外，在3D培養中生長的癌細胞由于不均勻地暴露于氧氣和營養物質，可表現出增加的致瘤表型。因此，采用低生理活性氧水平和球體形成特性的細胞培養來研究HNSCC中的CSC亞群（圖1）。在正常細胞中，CD44+CD24-和CD133+細胞亞群分別為10.1%和1.14%（圖1A）。用CellROX對低活性氧和高活性氧種群分類，細胞內ROS水平被廣泛地用于豐富CSC（圖1B）。細胞分選后， CD44+CD24和CD133+細胞（ROS-low細胞）明顯高于CD44+CD24和CD133+細胞（ROS-high細胞）和正常細胞（圖1C-E）。ROS-low細胞表現出由CPDL和順鉑耐藥性（cisplatin）決定的CSC特性（圖1F，G）。同樣， CD44+CD24細胞和CD133+細胞數量分別增加了42.9%和3.41%（圖1H-J）。3D培養的SCC-25細胞對順鉑的耐藥性增強（圖1K）。這些結果表明，在3D培養以及低水平ROS的條件下，HNSCC培養物含有豐富的干細胞群，并表現出CSC樣特性。

圖1 在ROS-low和球形細胞培養中CSCs的特性

2.  Mel和VP聯合處理可誘導細胞凋亡，降低HNSCC細胞的CSC樣特性

為了證明Mel和VP對HNSCC生長的影響，分析了Mel或VP處理后SCC-25細胞的細胞活力（圖2A）。單用Mel或VP以劑量依賴的方式抑制細胞活力（圖2A）。無論細胞ROS水平如何，Mel （1 mM）和VP （2.5 μm）聯合處理對HNSCC細胞活性有協同作用（圖2B）。盡管聯合治療組中觀察到pAkt/Akt的表達呈下降趨勢，但治療并未改變pAkt/Akt的表達。在聯合治療組中，Cleaved Cas-3/Cas-3表達上調，表明Mel和VP促進HNSCC細胞凋亡（圖2C，D）。治療后進一步觀察SCC-25細胞的CSCs特征。Mel和VP單獨處理降低了細胞的成球能力，增加了細胞的線粒體ROS水平（圖2E-J）。此外，聯合處理大大降低了細胞的成球能力和CSC數量，而增加線粒體ROS的產生（圖2E-J）。這些結果表明，Mel和VP抑制了HNSCC細胞的活力，并降低了HNSCC的特性和種群數量。

圖2 Mel和VP對CSC性能的影響

3.  Mel和VP抑制與線粒體自噬相關基因的表達

由于線粒體自噬與癌細胞的增殖和死亡有關，進一步研究了Mel和VP對SCC-25細胞中參與線粒體自噬的基因表達的影響（圖3）。VP單獨降低了PINK1的表達，與Mel聯合顯著降低了PINK1和parkin的表達（圖3A,B）。用Mel和VP處理ROS低和ROS高的SCC-25細胞，研究其對細胞自噬的調節作用。兩種ROS分類的細胞與正常的SCC-25細胞表現出相似的模式（圖3C-F）。聯合治療降低了PINK1和parkin的表達，而與細胞內ROS水平無關。然而，線粒體網絡相關蛋白FIS1（線粒體分裂）的片段化并未因治療而改變（圖3A-F）。綜上所述，這些結果表明Mel和VP通過線粒體自噬而不改變線粒體分裂來抑制HNSCC的生存能力。

圖3 Mel和VP治療后對線粒體自噬的調節

4.   Mel和VP可誘導線粒體功能障礙，減少線粒體自噬

使用TMRE（線粒體膜電位）染色標記活性線粒體，以顯示Mel和VP在線粒體損傷中的作用。Mel或VP單獨降低線粒體膜電位，它們的結合協同使線粒體失活（圖4A,B）。此外，用parkin和TOM20對細胞進行染色，觀察ROS-low和ROS-high細胞的線粒體形態和線粒體自噬的表達（圖4C,D）。聯合治療降低了ROS-low和ROS-high細胞中parkin和TOM20的表達。染色結果顯示，對照組的parkin/TOM20表達主要集中在細胞質中。該治療改變了相互連接的線粒體網絡，并將parkin/TOM20移至靠近細胞核的位置（圖4C）。這些數據表明，Mel和VP觸發線粒體損傷，導致線粒體自噬減少。

圖4 Mel和VP治療后線粒體功能和線粒體自噬的研究

5.  Mel和VP對HNSCC的抑制作用是通過調節YAP信號和PINK1依賴的線粒體動力學介導的

為了研究Mel和VP與YAP信號轉導的相關性，分析了Mel和VP處理后SCC-25細胞中YAP靶基因CCN1的表達（圖5A-C）。Mel和VP單獨降低了CCN1的RNA表達（圖5A）。Mel和VP共同作用后，CCN1在mRNA和蛋白水平上的表達均顯著降低（圖5A-C），說明Mel和VP可能直接下調YAP信號轉導，導致YAP靶基因CCN1的表達下降。MPP+ iodide（碘化物）進一步證實了線粒體功能障礙對HNSCC的影響。MPP+ iodide抑制線粒體復合物I，并消耗內源性PINK1，導致線粒體損傷。MPP+ iodide以劑量依賴性的方式顯著降低細胞活力（圖5D）。進一步評估MPP+ iodide處理的SCC-25細胞中CD44+CD24細胞的百分比（圖5E,F）。MPP+ iodide未改變CD44+CD24細胞群。這些結果表明，抑制PINK1可導致HNSCC細胞死亡，而不影響干細胞數量。

圖5 Mel和VP對YAP信號轉導的調控及PINK1依賴線粒體動力學的抑制作用

6. Mel和VP抑制HNSCC的上皮間質轉化和遷移

EMT在促進腫瘤的侵襲轉移方面起著重要作用。為了進一步驗證Mel和VP對EMT介導的腫瘤進展的影響，分析了SCC-25細胞中上皮和間充質標志物的表達（圖6A,B）。TGF-β1誘導SCC-25細胞發生EMT：包括Vim和N-cad在內的間質標志物在TGF-β1作用下表達升高，而E-cad在TGF-β1作用下表達略有降低（圖6A,B）。聯合治療組間充質標志物的表達顯著降低，而上皮標志物的表達在各治療組中略有恢復（圖6A,B）。傷口愈合實驗結果表明，Mel或VP均顯著減少了傷口愈合面積。此外，聯合治療后細胞很少增殖并遷移到劃傷區域（約4%）（圖6C,D）。在Transwell遷移實驗中，Mel和VP減少了向上腔室下表面遷移的細胞數量（圖6E,F）。此外，與癌癥侵襲轉移相關的MMP-2和MMP-9在Mel和VP處理的細胞中表達下調（圖6G,H）。這些發現提示Mel和VP可能是HNSCC中EMT、遷移和轉移的關鍵調控因子。

圖6 Mel和VP治療后EMT和轉移的調節作用

主要研究結論：

綜上所述，研究結果表明ROS-low HNSCC細胞和HNSCC的3D球形培養物表現出增強的CSC特性。此外，Mel和VP通過調節HNSCC中的PINK1/parkin/TOM20軸，導致線粒體損傷和線粒體吞噬功能降低。Mel和VP聯合治療通過調節EMT減少癌細胞轉移。因此，Mel和VP聯合治療可能是HNSCC患者的潛在治療策略。