脊髓損傷（SCI）導致巨噬細胞/小膠質細胞的免疫激活。激活的巨噬細胞/小膠質細胞具有兩種表型：M1促炎經典活化表型和M2抗炎選擇性活化表型。SCI的治療由于缺乏能穿越血腦屏障（BBB）且具有靶向性和有效抗炎藥物，因而面臨巨大挑戰。本文發現M2巨噬細胞來源的外泌體裝載小檗堿可用于治療SCI通過抑制M1炎癥激活和抗凋亡。本文于2021年5月發表在《Acta Biomaterialia》IF：8.947期刊上。

技術路線：

實驗設計：

主要實驗結果：

1、外泌體鑒定

Exos和Exos-Ber使用低溫超速離心法收集，電鏡下觀察到的形態如圖1A所示，Exos具有一個完全薄膜結構，大約125nm大小。裝載Ber后結構無明顯變化。Exos和Exos-Ber顆粒大小的分布都在125±12nm。Exos-Ber熒光共定位顯示DiD標記的外泌體膜具有紅色熒光和Ber綠色熒光，合并圖像表明Ber已經裝載至外泌體中，因為綠色熒光在紅色熒光里面（圖1C）。WB在Exos和Exos-Ber中都檢測到了典型的外泌體標志物的表達。穩定性試驗表明在7天內Exos和Exos-Ber都無明顯改變，說明藥物裝載系統穩定（圖1E）。此外，凍干前后Exos-Ber的大小和zeta電位無明顯變化（圖1F）。

圖1 Exo和Exo-Ber的鑒定

2、藥物裝載，釋放，和Exo-Ber的攝取

用超聲波將Ber裝入Exos中。圖2A中，Exo-Ber中Ber含量超聲波法(17.13±1.64%)高于孵育法(5.00±0.70%)。隨后進行體外釋藥試驗，結果如圖2B所示。Exo-Ber在體外表現出緩慢的釋放行為。48 h累積釋放量為71.44±2.86%。在體外細胞攝取試驗中，清楚地觀察到，隨著時間的推移，Exos被BV2細胞的攝取增加(圖2C-2D)。此外，流式細胞術進一步證明了Exos的攝取，并顯示出時間依賴性(圖2E)。

圖2 體外釋放和細胞攝取Exo-Ber

3、Exo靶向評估

為了驗證Exo穿透BBB的能力，作者構建了一個體內SCI模型小鼠，在尾靜脈注射Exo-Ber后的1，3，6，12和24h進行體內成像，如圖3A所示，對照ReVs顯示出自然被動定位，在注射12小時后只有少量聚集在損傷部位，而與此相反，Exos表現出積極的靶向效應，受損部位的熒光強度在在注射3h后顯著增加并隨著時間逐漸增長。在12h，增長趨勢下降，熒光強度在24h到達峰值（圖3B）。大腦和脊髓的組織成像進一步證明了Exos的靶向性（圖3C）。

圖3 體內靶向Exo-Ber

4、體外抗炎效果

巨噬細胞/小膠質細胞體外LPS處理后極化為M1型促炎細胞(表達iNOS)。如圖4A所示，LPS組表達強烈iNOS綠色熒光，意味著M1極化，Ber組和Exo組具有相對較弱的綠色熒光，表明它們都可以抑制M1極化。Exo-Ber表現出最弱的綠色熒光，說明具有最好的M1極化抑制效果。M2巨噬細胞/小膠質細胞是抗炎細胞（表達CD206），Exos-Ber誘導小膠質細胞由M1型向M2型轉化（圖4B）。流式得出和免疫熒光一樣的結果（圖4C-4D）。促炎因子（TNFα, IL-1β and IL-6）的水平在LPS組最高，相比之下，Ber組和Exo組的水平顯著降低，而Exos-Ber組的促炎因子水平最低表明具有最好的抗炎效果（圖4E）。

圖4表征Exos-Ber在體外抑制M1 BV2細胞激活和促進M2 BV2細胞極化特性

5、Exos-Ber保護神經元并促進SCI后的運動功能恢復

圖5A展示了構建模型過程中的SCI小鼠的傷口表面圖像。為了評估Exos-Ber治療效果，使用了BMS得分評估SCI小鼠的運動恢復，如圖5B，在第3天和第7日安，只有Exos-Ber組小鼠得分顯著升高，并隨著時間發展得分越來越高，而其余組則沒有顯著升高，表面Exos-Ber組具有最好的恢復效果，其小鼠足底頻繁且持續站立，但仍不穩定（圖5C）。此外，各組小鼠的體重無顯著差異，PBS組小鼠體重在傷后一周逐漸恢復，Exos-Ber組傷后1周體重略有下降，后逐漸好轉，28 d時體重略有增加。為探討Exos-Ber對脊髓損傷后運動神經元存活的影響，采用尼氏染色法觀察脊髓損傷后運動神經元存活情況。與PBS組相比，Ber組和Exos組的神經元數量增，Exos-Ber組神經元更多，證實了Exos-Ber恢復效果良好（圖5E）。為了評估Exos-Ber的安全性，對各種器官和組織(心、肝、脾、肺和腎)進行了HE染色。結果如圖5F所示，未發現明顯變化，說明Exos-Ber具有生物安全性。

圖5 Exos-Ber可以更好的促進SCI后神經元存活和功能恢復和準備工作的安全性評價

6、體內抗炎效果

為探討Exos-Ber對脊髓損傷后炎癥反應的抑制程度，采用Elisa和western blotting檢測脊髓組織中IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表達水平，評價損傷部位的炎癥反應水平。如圖6A和6B所示，與sham組相比，PBS組炎癥因子水平顯著升高，與PBS組相比，Ber組和Exo組其水平都顯著下降，但是和Exo組比較，Exo-Ber組的水平再次下降，表明Exo-Ber抗炎效果最好。隨后用免疫熒光檢測了巨噬細胞/小膠質細胞的的標記物，發現Exo-Ber抑制M1標記物表達的效果最顯著，促進M2標記物的能力也最顯著，表明Exo-Ber可以抑制巨噬細胞/小膠質細胞極化。

圖6 Exo-Ber可以減輕受損部位炎癥反應通過抑制M1巨噬細胞/小膠質細胞激活

隨后作者還檢測了抗凋亡蛋白（(caspase-9, caspase-8, Bcl-2, BAX, BAX/Bcl-2）以評估Exo-Ber的抗凋亡作用。如圖7A所示，與PBS組相比，Exo組，Ber組和Exo-Ber組的這些蛋白表達水平顯著下降，表明它們具有抗凋亡作用，而Exo-Ber具有最佳效果。圖7Bcleavedcaspase 3/Neun免疫熒光結果也證實了這個結論。

圖7 Exos-Ber抑制SCI小鼠的神經元凋亡

總之，在本研究中，作者成功制備了粒徑約125 nm的Exos-Ber，封裝效率約為17.13%。Exos的自然靶向能力可以實現Ber在損傷部位的高濃度積累。藥代動力學實驗表明，與Ber溶液相比，Exos-Ber的生物利用度提高了3.2倍。Exos-Ber誘導小膠質細胞過度活化，由促炎M1型小膠質細胞向抗炎M2型小膠質細胞過渡，抑制促炎因子的表達，它還能減少脊髓損傷后的神經元凋亡，促進運動功能恢復。綜上所述，Exos-Ber是治療脊髓損傷較好的抗炎藥物。

參考文獻：

Gao Zhan-Shan., Zhang Chuan-Jie., Xia Nan., Tian He., Li Dao-Yong., Lin Jia-Quan., Mei Xi-Fan., Wu Chao.(2021). Berberine-loaded M2 macrophage-derived exosomes for spinal cord injury therapy. Acta Biomater, 126(undefined), 211-223. doi:10.1016/j.actbio.2021.03.018