胃癌（GC）是嚴重危害人類健康的惡性腫瘤之一。GC轉移是癌癥治療失敗的主要原因之一，但m6A與GC轉移之間的相關性報道較少。在GC樣本中檢測到ALKBH5表達降低，并且與臨床腫瘤遠端轉移和淋巴結轉移相關。ALKBH5干擾促進了GC細胞的轉移，這種作用與ALKBH5的去甲基化酶活性密切相關。PKMYT1作為ALKBH5的下游靶點，促進了GC的侵襲和遷移。由ALKBH5敲除或其去甲基化酶活性突變引起的PKMYT1表達上調表明，ALKBH5以m6A依賴的方式調節PKMYT1的表達。IGF2BP3通過其m6A修飾位點幫助穩定PKMYT1的mRNA穩定性。本研究建立了ALKBH5-PKMYT1-IGF2BP3在轉移中的調節系統，代表了GC轉移的新治療靶點。本文于2022年2月發表于Molecular Cancer（IF=27.401）上。

技術路線

結果

1）MeRIP?seq揭示了m6A修飾基因與GC細胞粘附之間的強相關性，脫甲基酶ALKBH5的下調與GC預后相關

為了評估GC中m6A修飾的總體水平，隨機選擇5對臨床腫瘤組織和相鄰的正常樣本。使用EpiQuik m6A RNA甲基化定量試劑盒，我們觀察到GC組織中m6A的水平顯著高于相鄰正常組織（圖1A），表明m6A可能參與GC的發生或進展。選擇三對組織進行進一步甲基化RNA免疫沉淀測序（MeRIPseq）。在三對組織的MeRIP-seq分析中，m6A信號主要發生在mRNA轉錄本的終止密碼子和3'UTR附近（圖1B）。m6A修飾集中在GGACU基序上（圖1C）。大多數基因在腫瘤組織中表現出較高水平的m6A修飾和mRNA表達（圖1D）。GO分析表明，這些基因主要富集于細胞間粘附和上皮細胞遷移（圖1E）。通過數據分析確定，大多數在腫瘤組織中表現出高m6A水平的基因也表現出顯著高于相鄰正常組織的mRNA水平（圖1F）。

M6A水平主要由甲基轉移酶和去甲基酶平衡，而甲基轉移酶METTL3和METTL14被報道調節GC進展。然而，GC中去甲基化的機制報道較少。為了探索參與細胞遷移的關鍵去甲基化酶，利用TCGA數據庫探索了m6A相關酶和遷移相關基因之間的相關性。數據顯示ALKBH5與這些基因呈顯著負相關，而FTO主要與它們呈正相關(圖1G)。檢測49例患者的GC組織和正常組織中的mRNA水平表明，ALKBH5在GC組織中的低水平表達顯著，而GC和正常組織之間的FTO表達沒有ALKBH5顯著（圖1H）。因此，我們重點研究了ALKBH5的表達及其在胃癌轉移中的可能機制。TCGA和GEO數據庫均顯示GC中ALKBH5表達降低（圖1I-J）。組織微陣列的統計分析還顯示，相鄰正常組織中ALKBH5的蛋白質水平顯著升高（圖1K-L）。ROC曲線表明，ALKBH5對GC的臨床診斷具有高度敏感性和特異性（圖1M）。生存分析還表明，ALKBH5高表達的患者預后改善（圖1N）。臨床統計顯示，有遠處轉移的患者ALKBH5的表達低于無遠處轉移的患者（圖1O）。在淋巴結轉移組中也觀察到類似的結果（圖1P）。綜上所述，ALKBH5的低表達可能是胃癌轉移的根源。

2）ALKBH5在體外抑制GC的侵襲和遷移

為了挖掘ALKBH5在GC進展中的潛在特征，我們進行了細胞實驗。在HGC-27和BGC-823細胞中建立了ALKBH5的穩定過表達(圖2A-B)。我們還沉默了SGC-7901細胞中的ALKBH5（圖2C-D）。經transwell分析驗證，ALKBH5過表達后，GC細胞的轉移能力明顯受到抑制（圖2E、G），而在SGC-7901細胞中，ALKBH5敲除顯著增強了GC細胞的轉移能力（圖2F、H）。傷口愈合試驗發現，ALKBH5的上調顯著抑制GC細胞的遷移能力（圖2I）。ALKBH5表達的減弱加速了GC細胞的遷移（圖2J）。為了闡明m6A在遷移中的作用，我們在HGC-27細胞中使用了ALKBH5 H204A突變體（圖2K）。結果表明，ALKBH5突變對其mRNA或蛋白質水平的影響較小（圖2M-N），但ALKBH5 H204A細胞中的m6A水平明顯高于LV-ALKBH5 GC細胞（圖2L）。與ALKBH5過表達相比，突變組的遷移和侵襲能力也增強（圖2O-P）。這些數據表明，ALKBH5過表達對細胞侵襲的抑制主要取決于其去甲基酶活性。

3）PKMYT1被確定為ALKBH5的下游靶點

為了確定在ALKBH5下游起關鍵作用的主要靶基因，我們進行了MeRIP-seq和RNA-seq。為了進一步鑒定GC中必需的下游靶基因，我們進行GEPIA數據庫分析和參考相關文獻，確定四個候選基因（PKMYT1、NT5E、PXDN和MYH9）（圖3A）。使用MeRIP-qRT-PCR和mRNA水平驗證，我們發現當ALKBH5過表達或破壞時，只有PKMYT1表現出穩定的改變（圖3B-F）。ALKBH5干擾SGC-7901細胞后，PKMYT1的m6A水平穩定增加（圖3B）。PKMYT1的表達在過表達ALKBH5后顯著降低（圖3C-D），在干擾ALKBH5后顯著增加（圖3E-F）。RIP和RNA下拉試驗均證明了ALKBH5和PKMYT1轉錄本之間的結合（圖3G-H）。因此，我們初步懷疑PKMYT1可能是ALKBH5的下游效應器。

組織微陣列和TCGA數據庫結果均顯示PKMYT1在GC中高表達，其表達與不良預后密切相關（圖3I-M）。ROC分析表明，PKMYT1在臨床GC診斷中具有顯著的差異性（圖3N）。組織微陣列表達統計顯示，ALKBH5和PKMYT1表達之間存在顯著的負相關（圖3O）。為了驗證PKMYT1在GC轉移中的獨特作用，我們首先在GC細胞系中進行PKMYT1破壞和過表達。transwell分析表明，PKMYT1過表達后，GC細胞的轉移能力明顯增強（圖S3H-J）。為了觀察ALKBH5/PKMYT1對胃癌轉移的影響，進行了一項挽救實驗。結果顯示，PKMYT1的過表達顯著恢復了由ALKBH5過表達引起的轉移能力（圖3P-R），這些結果表明PKMYT1是ALKBH5的下游。

4）PKMYT1以m6A依賴的方式促進GC的侵襲和遷移

為了確定受ALKBH5影響的特定m6A位點，使用SRAMP網站預測PKMYT1的mRNA序列。預測結果顯示，在PKMYT1的mRNA序列中，有五個潛在的m6A修飾位點具有非常高的可信度（圖4A）。然后，設計了這五個位點的特異性引物。MeRIP-qRT-PCR顯示，在ALKBH5過表達后，前兩個位點對應的片段m6A水平顯著降低(圖4B)。當涉及ALKBH5去甲基化酶活性的殘基發生突變時，它們的m6A水平得到恢復（圖4B）。我們的數據表明PKMYT1 mRNA上的兩個位點可能是ALKBH5調節的特定位置。在MeRIP-seq中也檢查了GC組織中這兩個位點的m6A水平。來自IGV基因組瀏覽器的結果表明，與正常組織相比，GC中兩個位點的m6A修飾水平明顯更高（圖4C）。這兩個位點的突變旨在觀察m6A修飾對PKMYT1的影響（圖4D）。結果顯示，突變組PKMYT1的整體水平降低（圖4E-F）。這兩個位點的突變導致GC轉移能力顯著降低。這種現象在ALKBH5敲除后更為明顯(圖4G-H)。因此，PKMYT1以依賴于m6A的方式促進GC的侵襲和遷移。

5）PKMYT1 mRNA的M6A修飾通過IGF2BP3維持其穩定性

眾所周知，m6A修飾主要依賴于“讀取器”蛋白發揮額外功能。為了進一步研究PKMYT1的m6A修飾中潛在的“讀取器”蛋白，進行了RNA下拉實驗和質譜分析。質譜分析結果表明，IGF2BP3和RBMX在m6A修飾PKMYT1后可能發揮作用，而IGF2BP3的得分遠高于RBMX（圖5A）。我們選擇IGF2BP3進行驗證。RNA下拉和RIP分析均表明IGF2BP3可與PKMYT1 mRNA結合（圖5B-C）。組織微陣列和TCGA數據庫均顯示IGF2BP3在GC中高表達，其高表達對GC患者預后不良（圖5D-G）。組織微陣列和TCGA數據庫結果均顯示IGF2BP3和PKMYT1在GC中的表達呈顯著正相關（圖5H-I）。細胞系驗證實驗證實，干擾IGF2BP3后，PKMYT1的表達顯著降低（圖5J-K）。

據報道，m6A讀取器蛋白IGF2BP3主要通過增強mRNA穩定性發揮作用。因此，我們評估了干擾和過表達ALKBH5后PKMYT1 mRNA的穩定性。研究發現，在放線菌素D處理下過表達ALKBH5后，PKMYT1的mRNA穩定性顯著降低，但在干擾ALKBH5后，PKMYT1的mRNA穩定性顯著增加（圖5L-M）。在ALKBH5 H204A組中，PKMYT1 mRNA的穩定性得到恢復（圖5N）。在干擾IGF2BP3后，觀察到PKMYT1的mRNA穩定性顯著降低（圖5O）。為了研究m6A位點修飾對PKMYT1 mRNA穩定性的影響，在放線菌素D的作用下，用PKMYT1-CDS、mut1和mut2質粒轉染GC細胞。觀察到，這兩個位點突變后，PKMYT1 mRNA的穩定性也降低了(圖5P)。為了進一步探討IGF2BP3和PKMYT1的m6A修飾位點之間的關系，我們采用體外轉錄分析和生物素標記的方法，分別合成了包含PKMYT1中單個m6A修飾位點突變的全長mRNA序列。在RNA下拉試驗中，使用鏈霉親和素結合免疫磁珠驗證IGF2BP3和PKMYT1 mRNA之間的直接相互作用。發現在這兩個位點突變后，IGF2BP3與PKMYT1 mRNA的結合能力顯著下降（圖5Q）。RIP分析也證實了類似的結果（圖5R）。

6）ALKBH5、PKMYT1和IGF2BP3在體內的相關性

我們分別使用組織微陣列和TCGA數據庫對腫瘤遠處轉移組和淋巴結轉移組中PKMYT1和IGF2BP3的表達進行分析（圖6A-D）。轉移組PKMYT1的表達明顯高于非轉移組（圖6A，C）。IGF2BP3和PKMYT1表現出相同的現象（圖6B，D）。生存分析顯示，高ALKBH5和低PKMYT1表達的患者預后最佳（圖6 E）。值得注意的是，PKMYT1和IGF2BP3低表達的患者預后也最好（圖6F）。接著，我們采用尾靜脈注射法建立裸鼠腫瘤肺轉移模型。通過分子成像軟件觀察肺轉移的形成。ALKBH5的過表達降低了這些細胞形成肺轉移的能力（圖6G-H），而ALKBH5的突變（H204A）挽救了這種能力（圖6G-H）。相反，ALKBH5的敲除顯著加快了小鼠轉移的形成（圖6I-J）。肺組織切片的HE染色也顯示，GC細胞中ALKBH5過表達后，轉移性結節的數量顯著減少（圖6K-L）。通過IHC評估肺組織切片轉移結節中ALKBH5和PKMYT1表達的相關性（圖6M-N）。PKMYT1的表達在ALKBH5過表達后明顯受到抑制，但在ALKBH5突變后得到恢復（圖6M-N）。ALKBH5敲除后觀察到相反的結果（圖6O-R）。

結論：我們確定ALKBH5是GC轉移中的一種腫瘤抑制因子，這種作用依賴于ALKBH5的去甲基化酶活性。PKMYT1是ALKBH5的下游靶基因，經m6A修飾后可被IGF2BP3識別和結合。PKMYT1的mRNA穩定性增強，導致更高的表達水平，最終顯著促進GC轉移。

參考文獻：

Hu Y, Gong C, Li Z, Liu J, Chen Y, Huang Y, Luo Q, Wang S, Hou Y, Yang S, Xiao Y. Demethylase ALKBH5 suppresses invasion of gastric cancer via PKMYT1 m6A modification. Mol Cancer. 2022 Feb 3;21(1):34. doi: 10.1186/s12943-022-01522-y.