抗體介導(dǎo)的免疫是由B細(xì)胞分化為包括漿母細(xì)胞、記憶細(xì)胞和生發(fā)中心（GC）細(xì)胞在內(nèi)的多個(gè)細(xì)胞亞群引發(fā)的。B細(xì)胞的分化軌跡是由轉(zhuǎn)錄因子決定的，然而很少有專門決定早期B細(xì)胞命運(yùn)的機(jī)制被描述。本研究中，作者報(bào)道了一種抑制漿母細(xì)胞遺傳程序并促進(jìn) GC B細(xì)胞命運(yùn)的轉(zhuǎn)錄后機(jī)制。本研究于2022年5月發(fā)表在《Cell Reports》IF：9.995期刊上。

技術(shù)路線：

主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

1、YTHDF2由抗原特異性B細(xì)胞在pre-GC期表達(dá)

作者希望研究的是在最初的抗原相遇和GC形成之前的這段時(shí)期支持B細(xì)胞命運(yùn)決定的機(jī)制和基因程序。為了該目的，對(duì)免疫響應(yīng)后GC形成前的腘窩淋巴結(jié)的單細(xì)胞懸液進(jìn)行scRNA-seq檢測(cè)。利用UMAP降維分析了6263個(gè)細(xì)胞，識(shí)別了6個(gè)簇，并根據(jù)它們的基因表達(dá)特征對(duì)它們進(jìn)行了注釋（Figures 1A, 1B）。其中一個(gè)簇的特征是Igkc和Ighd高表達(dá)，Iglc1的低水平表達(dá)，并且由于 NP 特異性細(xì)胞在B1-8 hi轉(zhuǎn)基因小鼠中表達(dá)Igl，所以這個(gè)簇被定義為對(duì)抗原沒有反應(yīng)的原始B細(xì)胞（Figures 1B, 1C）。有兩個(gè)簇顯示了Fas、Cd86和GC轉(zhuǎn)錄因子Bcl6的高表達(dá)，提示這些細(xì)胞處于向GC B細(xì)胞分化的過程中（Figures 1B, 1C）。另一個(gè)簇表達(dá)激活標(biāo)記Cd86和Fas以及高水平的趨化因子受體Ccr6，這是早期形成記憶細(xì)胞(eMBC)的典型特征。一個(gè)簇表達(dá)Cd86和Fas，但缺乏GC標(biāo)記，因此被定義為pre-GC細(xì)胞。從純化細(xì)胞群的RNA-seq數(shù)據(jù)集中提取的基因特征用于驗(yàn)證每個(gè)集群的細(xì)胞分配（Figures 1C）。正如預(yù)期的那樣，細(xì)胞周期分析表明，原始細(xì)胞和eMBC大部分是非周期細(xì)胞，而一些pre-GC細(xì)胞和大部分早期GC B細(xì)胞是積極增殖的（Figures 1D）。利用假時(shí)間順序?qū)⒓?xì)胞沿可能的發(fā)育軌跡放置，可以預(yù)測(cè)pre-GC簇可能產(chǎn)生GC B細(xì)胞以及eMBC細(xì)胞亞群（Figures 1E）。因此，使用scRNA-seq能夠識(shí)別pre-GC和具有形成成熟GC細(xì)胞能力的早期GC B細(xì)胞。

為了確定可能指導(dǎo)早期B細(xì)胞向GC B細(xì)胞定型的分子機(jī)制，對(duì)在pre-GC 簇中高表達(dá)的基因進(jìn)行了GO富集分析，與原始和eMBC簇相比。在符合這些標(biāo)準(zhǔn)的 991個(gè)基因中，359 個(gè)基因被注釋為編碼RBP的基因（Figures 1F）。為了進(jìn)一步表征早期進(jìn)入GC B細(xì)胞期間RBP的表達(dá)，查詢了所有注釋為編碼RBP 的基因 (GO: 0003723)。該分析證實(shí)，pre-GC細(xì)胞以及早期GC簇的細(xì)胞表現(xiàn)出最高的編碼RBP基因的表達(dá)水平（Figures 1G）。這些結(jié)果表明RBP在早期B細(xì)胞分化和GC形成中發(fā)揮作用。

有趣的是，編碼m6a結(jié)合蛋白的Ythdf2是符合富集標(biāo)準(zhǔn)的基因之一（在從原始細(xì)胞到pre-GC細(xì)胞的過渡期間，表達(dá)顯著增加）（Figures 1H）。通過對(duì)Ythdf2表達(dá)作為偽時(shí)間函數(shù)的分析發(fā)現(xiàn)，它在發(fā)育軌跡的早期上調(diào)，從pre-GC細(xì)胞開始，在早期GC亞群中保持上調(diào)（Figures 1H, 1I）。Ythdf蛋白家族包含3個(gè)同源基因，然而，在整個(gè)B細(xì)胞系中，Ythdf1和Ythdf3的表達(dá)顯著低于Ythdf2（Figure 1I）。與此相一致的是，利用qRT-PCR和多個(gè)引物對(duì)分選的B1-8 hi B細(xì)胞進(jìn)行分析，證實(shí)Ythdf2在免疫反應(yīng)早期被誘導(dǎo)，并在抗原特異性B細(xì)胞中占主導(dǎo)地位（Figure1J）。這些結(jié)果表明Ythdf2h是naive B細(xì)胞通過pre-GC狀態(tài)向早期分化的GC細(xì)胞轉(zhuǎn)變的潛在調(diào)節(jié)劑。

圖1 YTHDF2在生發(fā)中心形成前B 細(xì)胞激活后上調(diào)表達(dá)

2、抗原特異性B細(xì)胞定位于淋巴結(jié)外濾泡區(qū)表達(dá)YTHDF2

接下來，確定YTHDF2蛋白在早期B細(xì)胞活化和GC形成過程中在B細(xì)胞中的表達(dá)模式。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示GL-7+ FAS+ B細(xì)胞在免疫應(yīng)答第3天表達(dá)YTHDF2蛋白最多，第5天和第7天逐漸減少（Figure 2A）。在多克隆免疫反應(yīng)中也觀察到 YTHDF2 對(duì)疫苗接種的強(qiáng)烈上調(diào)，該免疫反應(yīng)包括表達(dá)具有不同特異性和親和力的免疫球蛋白的 B 細(xì)胞（Figure 2B）。因此，YTHDF2在抗原特異性B細(xì)胞免疫應(yīng)答早期上調(diào)，并且在GC形成期持續(xù)表達(dá)。

為了檢測(cè)B細(xì)胞在體內(nèi)表達(dá)YTHDF2的部位，將表達(dá)YTHDF2-GFP的TdTomato+ B1-8hi B細(xì)胞轉(zhuǎn)入宿主小鼠。在反應(yīng)的第3天，約50%的TdTomato+ B1-8hi B細(xì)胞定位至靠近淋巴結(jié)包膜區(qū)域并高表達(dá)YTHDF2-GFP，并且其表達(dá)頻率在淋巴結(jié)皮層深處的區(qū)域下降（Figures 2C, 2D）。運(yùn)動(dòng)B細(xì)胞的實(shí)時(shí)成像顯示，YTHDF2存在于細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，包括前緣和后緣；然而，由于尾緣含有較多的細(xì)胞質(zhì)，大部分的YTHDF2蛋白質(zhì)都位于這一區(qū)域（Figures 2E）。為了研究免疫球蛋白親和性是否影響YTHDF2的表達(dá)，將B細(xì)胞轉(zhuǎn)入表達(dá)低親和性NP特異性BCRs (B1-8lo)和YTHDF2-GFP的小鼠，并將GFP表達(dá)與B1-8hi B細(xì)胞進(jìn)行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在NP-KLH免疫后3天，B1-8hi B細(xì)胞表達(dá)的YTHDF2水平高于低親和力的細(xì)胞（Figure 2F）。綜上所述，這些結(jié)果表明YTHDF2在位于淋巴結(jié)濾泡外區(qū)的B細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，且BCR親和力調(diào)節(jié)其表達(dá)。

圖2 YTHDF2蛋白表達(dá)在生發(fā)中心形成前上調(diào)

3、生發(fā)中心的形成依賴于YTHDF2

為了確定YTHDF2是否在抗體免疫反應(yīng)中發(fā)揮作用，將Ythd2fl /fl小鼠與B細(xì)胞特異性CD23-Cre小鼠株（CD23-DF2fl/+和CD23-DF2fl/fl）雜交。ELISA結(jié)果顯示，表達(dá)一個(gè)或兩個(gè)Ythdf2-flox拷貝的小鼠血清IgM和IgG1水平較低，表明該基因是單倍不足的（Figure 3A）。為檢測(cè)抗原特異性抗體的產(chǎn)生情況，用NP-KLH免疫小鼠，免疫1周和2周后ELISA檢測(cè)血清中NP特異性抗體的存在情況。與野生型相比，CD23-DF2fl/fl小鼠在GC形成的第7天產(chǎn)生低水平的抗體；然而，這種差異在統(tǒng)計(jì)上并不顯著（Figure 3B）。反應(yīng)第14天GC形成后，CD23-DF2fl/fl中檢測(cè)到極低水平的抗原特異性抗體，而CD23-DF2fl/+產(chǎn)生了結(jié)合總NPs和低密度NPs的IgG1（Figure 3B）。總的來說，這些實(shí)驗(yàn)表明，一個(gè)有效的抗體介導(dǎo)的免疫反應(yīng)依賴于YTHDF2。

由于GC是抗體形成細(xì)胞的主要來源，接下來確定GC的形成是否依賴于YTHDF2。首先通過WT小鼠腹腔注射OVA啟動(dòng)，然后過繼CD23-DF2fl/fl或WT B1-8hi naive B細(xì)胞，然后用NP-OVA增強(qiáng)（Figure 3C）。流式細(xì)胞術(shù)分析增強(qiáng)7天后腘淋巴結(jié)來源的細(xì)胞，結(jié)果顯示，CD23-DF2fl/fl B1-8hi B細(xì)胞經(jīng)過繼后分化為GC細(xì)胞的比例比對(duì)照細(xì)胞低3.9倍（Figure 3D）。與對(duì)照組相比，缺乏Ythdf2的B細(xì)胞的PC/GC比率降低不明顯，且PC/GC比率較高（Figure 3D）。流式細(xì)胞術(shù)分析少數(shù)CD23-DF2fl/fl B1-8hi GC B細(xì)胞未表達(dá)YTHDF2-GFP（Figure 3E）。為了進(jìn)一步研究YTHDF2在GC形成中的意義，將WT和YTHDF2缺失的B1-8hi B細(xì)胞混合轉(zhuǎn)移到WT宿主體內(nèi)，然后給它們注射NP-OVA促進(jìn)劑。7d后的流式細(xì)胞儀分析顯示，在競爭條件下，Ythdf2缺陷的B1-8hi B細(xì)胞分化為GC細(xì)胞的能力完全受阻（Figure 3F）。因此，YTHDF2對(duì)產(chǎn)生完整的抗體介導(dǎo)的免疫反應(yīng)至關(guān)重要，主要是通過促進(jìn)GC的形成。

圖3YTHDF2是有效的抗體介導(dǎo)的免疫反應(yīng)和生發(fā)中心形成所必需的

4、YTHDF2是生發(fā)中心形成所必需的而不是早期B細(xì)胞激活所需

為了評(píng)估YTHDF2是否是早期階段B細(xì)胞免疫應(yīng)答所必須的，將WT和YTHDF2缺陷的B1-8hi B細(xì)胞一起轉(zhuǎn)入宿主小鼠，并在NP-KLH免疫后3-7天通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)FAS+ GL-7+ B細(xì)胞的存在。結(jié)果顯示，在GC形成前的免疫反應(yīng)第5天，YThdf2缺陷B細(xì)胞的頻率顯著降低（Figure 4A）。為了研究Ythdf2缺陷如何影響B(tài)細(xì)胞定位，使用TPLSM掃描完整的淋巴結(jié)。免疫后第5天淋巴結(jié)皮層可見CD23-DF2+/+ B1-8hi B細(xì)胞，第7天可見清晰的GC結(jié)構(gòu)（Figure 4B）。CD23-DF2fl/fl B1-8hi B細(xì)胞轉(zhuǎn)染小鼠后第5天檢測(cè)到細(xì)胞簇；但2 d后未形成成熟的GC，提示GC形成需要YTHDF2（Figure 4B）。為了確定YTHDF2是在GC形成過程中發(fā)揮作用，而不是在同源抗原的初始激活過程中發(fā)揮作用，檢測(cè)了YTHDF2缺陷的B細(xì)胞是否能夠在體內(nèi)對(duì)抗原作出反應(yīng)。免疫16 h后，Ythdf2缺陷的B細(xì)胞檢測(cè)到CD86、MHC-II、CD40等典型激活標(biāo)志物表達(dá)上調(diào)（Figure 4C）。此外，CellTrace Violet追蹤發(fā)現(xiàn)沒有早期B1-8hi B細(xì)胞增殖缺陷（Figure 4D）。此外，在體外，通過增加anti-IgM劑量刺激B細(xì)胞，并沒有發(fā)現(xiàn)任何顯著的增殖缺陷或CD86表達(dá)的Ythdf2缺陷B細(xì)胞（Figure 4E）。 因此，BCR參與觸發(fā)的B細(xì)胞活化和增殖不依賴于YTHDF2。

圖4 YTHDF2是早期B細(xì)胞免疫響應(yīng)所必需的而不是初始的B細(xì)胞激活所需

5、YTHDF2 抑制GC形成期間漿母細(xì)胞遺傳程序

體內(nèi)實(shí)驗(yàn)之間的差異表明，GC 形成對(duì) YTHDF2 有很大依賴性，而在沒有 YTHDF2 的情況下，早期 B 細(xì)胞活化和增殖沒有受到干擾，這表明這種 m6A 閱讀器在 B 細(xì)胞分化和命運(yùn)決定中發(fā)揮作用，而不是在細(xì)胞周期進(jìn)程和克隆擴(kuò)增中發(fā)揮作用。為了進(jìn)一步評(píng)估YTHDF2對(duì)B細(xì)胞發(fā)育哪個(gè)階段至關(guān)重要，研究了支持B細(xì)胞命運(yùn)的遺傳程序。篩選WT和Ythdf2缺陷的B1-8hi B細(xì)胞，這些細(xì)胞在免疫接種5天后對(duì)受體宿主的抗原產(chǎn)生反應(yīng)，并對(duì)它們進(jìn)行RNA-seq。總計(jì)獲得159個(gè)差異表達(dá)基因，值得注意的是，PB和PC中典型表達(dá)的基因，如Irf4、Xbp1、Sdc1和Prdm1，在Ythdf2缺陷的GL-7+ FAS+ B細(xì)胞中高表達(dá)（Figures 5A and 5B）。這些變化反映在GSEA揭示的ASC基因信號(hào)的表達(dá)增加（Figures 5C）。因此，YTHDF2在B細(xì)胞免疫反應(yīng)的早期階段抑制PB基因程序。

為了進(jìn)一步研究在缺乏YTHDF2的情況下早期反應(yīng)的B細(xì)胞的細(xì)胞命運(yùn)，進(jìn)行了scRNA-seq分析，共有11227個(gè)細(xì)胞顯示了類似于圖1中描述的集群（Figure 5D）。然而，盡管Ythdf2缺陷的B細(xì)胞分化為pre-GC和eMBC亞群，但它們形成的早期GC B細(xì)胞明顯較少（Figure 5E）。與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果一致，發(fā)現(xiàn)響應(yīng)的Ythdf2缺陷B細(xì)胞形成了相對(duì)更多的PC，與對(duì)照B細(xì)胞比較（Figure 5F）。接下來，研究了早期FAS+ GL-7+ Ythdf2缺陷的B細(xì)胞是否除了ASC基因表達(dá)增加外，還具有PB相關(guān)功能。為了確保亞型特異性轉(zhuǎn)錄本的檢測(cè)，使用分選的多克隆naive B細(xì)胞作為陰性對(duì)照，PC作為陽性對(duì)照。如預(yù)期的，如果有sIgM轉(zhuǎn)錄本的話，naive B細(xì)胞表現(xiàn)得非常低，而PC顯示sIgM與mIgM轉(zhuǎn)錄本的比例非常高（Figure 5G）。這些結(jié)果為YTHDF2在pre-GC和GC早期抑制PB遺傳程序中的作用提供了額外的證據(jù)。

圖5漿母細(xì)胞遺傳程序被 YTHDF2 抑制

6、YTHDF2直接與漿母細(xì)胞調(diào)節(jié)基因的甲基化mRNA相互作用

由于前文的研究結(jié)果表明YTHDF2在抑制PB遺傳程序中發(fā)揮作用，作者試圖確定該蛋白是否可以直接靶向PB促進(jìn)基因。為此，用脂多糖刺激分離的B細(xì)胞3天，在體外生成表達(dá)PB基因的細(xì)胞。然后，使用抗m6a抗體進(jìn)行RNA免疫沉淀，并使用高通量測(cè)序作為讀數(shù)。IP與對(duì)照組的比較顯示，在Ythdf2缺陷B細(xì)胞中上調(diào)的幾個(gè)PC分化基因，包括Prdm1、Sdc1、Xbp1和Irf4，顯示出一個(gè)或多個(gè)m6A峰（Figure 6A）。此外，通過分析已發(fā)表的YTHDF2 IP在B細(xì)胞發(fā)育過程中的數(shù)據(jù)集發(fā)現(xiàn)Irf4和Xbp1轉(zhuǎn)錄本都直接與YTHDF2結(jié)合（Figure 6B）。Sdc1也與YTHDF2結(jié)合；然而，這個(gè)峰值在缺乏mRNA甲基化機(jī)制的細(xì)胞中持續(xù)存在，表明非特異性結(jié)合。從LPS刺激的轉(zhuǎn)基因B細(xì)胞中提取HA-YTHDF2-GFP進(jìn)行RNA免疫沉淀，然后進(jìn)行qRT-PCR，得到類似的結(jié)果（Figure 6C）。這些發(fā)現(xiàn)表明YTHDF2有可能在轉(zhuǎn)錄后水平直接調(diào)節(jié)PC分化基因。

在早期反應(yīng)的B細(xì)胞中上調(diào)的PB相關(guān)基因中，Irf4被認(rèn)為是最上游的B細(xì)胞命運(yùn)調(diào)控因子。免疫后5天對(duì)CD23-DF2+/+和CD23-DFfl/fl細(xì)胞中IRF4蛋白表達(dá)的分析表明，與對(duì)照相比，CD23-DFfl/fl 細(xì)胞中顯示高水平 IRF4 的活化 CD138 陰性 B 細(xì)胞的頻率是對(duì)照組的 2.5 倍，并且通過平均熒光強(qiáng)度測(cè)量檢測(cè)到每個(gè)細(xì)胞的蛋白質(zhì)水平增加（Figure 6D）。激活的和Ythdf2缺乏的B細(xì)胞中也檢測(cè)到MYC蛋白水平的小幅升高（Figure 6E）。這些結(jié)果表明，YTHDF2具有通過調(diào)節(jié)IRF4 mRNA和蛋白表達(dá)水平直接調(diào)控PC形成的潛力。

圖6漿母細(xì)胞調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄物是 YTHDF2 的直接靶標(biāo)

7、生發(fā)中心和漿母細(xì)胞的形成不依賴于YTHDF1或YTHDF3

YTHDF蛋白在結(jié)構(gòu)上非常相似，幾項(xiàng)研究表明，所有三個(gè)同源段都促進(jìn)RNA降解，并可以補(bǔ)償任何同源段的損失。由于本文的結(jié)果顯示Ythdf2的一個(gè)等位基因不足以產(chǎn)生完整的抗體介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，所以測(cè)試了YTHDF1和YTHDF3是否也有助于GC的形成。與Ythdf2缺陷B細(xì)胞相反，過繼轉(zhuǎn)染Ythdf1-和Ythdd3缺陷B1-8hi B細(xì)胞可有效生成GC細(xì)胞和PC細(xì)胞（Figures 7A and 7B）。在競爭條件下檢測(cè)到Y(jié)thdf1缺陷的PCs和GC細(xì)胞頻率較高，而Ythdf3缺陷的B細(xì)胞這些細(xì)胞亞群的頻率沒有變化（Figures 7C and 7D）。這些結(jié)果表明，與YTHDF2相比，Ythdd1/3序列不通過對(duì)B細(xì)胞中YTHDF總蛋白庫的貢獻(xiàn)來促進(jìn)GC B細(xì)胞的形成。流式細(xì)胞儀檢測(cè)免疫后第3、5、7天B1-8hi B細(xì)胞，顯示FAS+ GL-7+ B1-8hi B細(xì)胞的形成不需要YTHDF1和YTHDF3（Figure 7E）。然而，來自免疫小鼠的FAS+ GL-7+ B1-8hi B細(xì)胞的RNA-seq實(shí)驗(yàn)顯示，在Ythdf2缺陷B細(xì)胞中顯著差異表達(dá)的基因在缺少Ythdf1和Ythdf3的情況下也發(fā)生了類似的改變，盡管程度較輕（Figures 7F and 7G）。雖然沒有在Ythdf1和Ythdf3缺陷B細(xì)胞的基因表達(dá)數(shù)據(jù)集中檢測(cè)到IRF4水平的增加，但在Ythdf3缺陷B細(xì)胞中觀察到ASC信號(hào)的增加（Figures 7G）。因此，YTHDF2在B細(xì)胞中起主導(dǎo)作用，而非YTHDF1和YTHDF3，這是由于它在B細(xì)胞中高表達(dá)。

圖7生發(fā)中心的形成不依賴于YTHDF1和YTHDF3

總之，本研究使用scRNA-seq 和轉(zhuǎn)基因小鼠證明YTHDF2由早期反應(yīng)的抗原特異性B細(xì)胞表達(dá)，并通過抑制與漿細(xì)胞形成相關(guān)的基因促進(jìn)其分化為生發(fā)中心 B細(xì)胞，而其他YTHDF旁系同源物對(duì)于體液免疫反應(yīng)是可有可無的。

圖8圖文摘要

參考文獻(xiàn)：

Grenov Amalie., Hezroni Hadas., Lasman Lior., Hanna Jacob H., Shulman Ziv. (2022). YTHDF2 suppresses the plasmablast genetic program and promotes germinal center formation. Cell Rep, 39(5), 110778. doi:10.1016/j.celrep.2022.110778