近日，有研究基于腫瘤浸潤免疫細胞程度和分子分型，建立了一種肺鱗癌免疫治療療效預測模型，該研究發表在《Journal of Translational Medicine》，IF: 8.44。

技術路線：

主要研究結果：

1. NMF分型將training set分為低免疫細胞浸潤型和高免疫細胞浸潤型

以TCGA數據庫中501例肺鱗癌（LUSC）患者的數據作為訓練集，根據單樣本基因集富集分析（GSEA）評估的瘤浸潤免疫細胞（TIICs）程度，采用非負矩陣分解（NMF）進行分組。結果發現，當rank值為2-3時，遺傳分型指數下降幅度最大（圖1A）。因此，選擇秩值2，將患者分為低免疫細胞浸潤型（cluster 1：C1）和高免疫細胞浸潤型（cluster 1：C2）。熱圖還顯示，當類型數量限制在兩種時，training set的樣本可以很好地區分（圖1B）。此外， tSNE降維（圖1C）和 PCA（圖1D）表明，C1和C2具有較好的識別能力，表明該分類方法的可行性。在C1和C2患者中，執行抗腫瘤免疫和執行促腫瘤免疫的細胞類型得分均存在顯著正相關（圖1E），C1患者的相關系數為0.86 （P=1.2e?56），C2患者的相關系數為0.83 （P=2.8e?82）。C2患者的抗腫瘤免疫（p<0.0001）和促腫瘤免疫（p<0.0001）富集評分顯著高于C1患者（圖1F）。此外，28種免疫細胞的富集分數存在顯著差異，其中C1型顯著低于C2型（圖1G）。這些結果提示LUSC的C1型可視為低免疫細胞浸潤的“冷腫瘤”，而C2型則傾向于高免疫細胞浸潤的“熱腫瘤”。這些結果表明，NMF分型對training set中的免疫細胞浸潤程度有較強的區分能力。

圖1 NMF分型將訓練集分為低免疫細胞浸潤型和高免疫細胞浸潤型

2. NMF分型的臨床病理特征

根據NMF分型，對training set中患者的幾個重要臨床病理特征進行了差異分析，包括年齡、性別、TNM分期和臨床分期。結果僅顯示兩種亞型在性別上有顯著差異。C1型患者中女性36例（7.19%），顯著低于C2型患者94例（18.76%）（P=0.0112）。各亞型間的其他臨床病理特征如年齡和分期無差異（表1）。隨后的生存分析顯示，兩種亞型間LUSC患者的OS （P=0.74，圖2A）和DFS （P=0.5，圖2B）均無顯著差異。

3. NMF類型間的DEGs主要參與免疫系統調節

通過差異分析，與C2型相比，C1型中有468個基因顯著上調，2179個基因顯著下調（圖2C）。GO富集分析顯示，DEGs主要富集于以下生物過程:免疫系統過程（48.50%）、免疫應答（42.02%）、免疫系統調節過程（27.84%）等（圖2D）。從細胞成分來看，主要富集在胞外區（37.87%）、膜內成分（15.40%）和膜內成分（14.78%）等（圖2E）。而在分子功能方面，這些基因主要富集在信號受體活性（16.61%）、分子換能器活性（16.61%）和信號受體結合（15.25%）等方面（圖2F）。KEGG富集分析顯示，DEGs主要參與細胞因子受體相互作用（12.75%）、趨化因子信號通路（8.55%）、病毒蛋白、病毒蛋白與細胞因子及細胞因子受體相互作用（7.46%）等途徑（圖2G）。

圖2 NMF類型間差異表達基因（DEGs）主要參與免疫系統調節

4. 構建17個基因的免疫浸潤預測模型

雖然NMF分型能較好地區分TIICs的豐度，但不能預測患者的生存預后。因此，需要在此前提下建立新的預測模型。取DEGs、影響患者OS和DFS的基因和兩個驗證集測序的基因（圖3A）這5個基因集的交集，共得到20個基因用于構建預測模型（圖3A）。通過LASSO回歸，共篩選出17個具有回歸系數的基因（圖3B）。另外，從圖3C可以看出，在考慮調優參數的最小值（λ）時，模型曲線下的ROC 面積 （AUC）值較大。通過構建nomogram預測模型對C2型患者的預測效果可視化（圖3D）。當IPTS=0.6369時，C1型和C2型患者患病的概率均為50%，且當IPTS值超過0.6369時，C2型患者患病的概率更高。此外，在1000次重復條件下，校準曲線（圖3E）的平均絕對誤差（MAE）為0.062，曲線擬合良好，預測效果良好。由該模型可以看出，回歸系數< 0的基因共有9個，可以作為C1型的基因簽名；8個回歸系數 > 0的基因可作為C2型的基因標記（圖3F），從而在一定程度上實現了分子分型。

圖3構建基于17個基因的免疫浸潤預測模型

5. 基于IPTS預測模型的分子分型可替代NMF分型

通過分析并繪制ROC曲線，AUC為0.82 （95% CI= 0.86-0.79）（圖4A），最大約登指數對應的截斷值在nomogram中預測概率為50%，即0.6369。此時ROC曲線預測敏感性為0.8038，特異性為0.7189，提示IPTS模型能較好預測LUSC患者的NMF分型。C2型患者IPTS顯著高于C1型患者（P=0.0026，圖4B）， C2型患者IPTS高于C1型患者數量顯著高于C1型患者（P<0.0001,表1）。初步認為基于IPTS的分子分型可以很好地預測NMF分型。為了進一步明確IPTS亞型分型是否可以替代NMF分型，還進行了差異分析和相關分析。如圖4C所示，高IPTS患者的抗腫瘤免疫（P<0.0001）和促腫瘤免疫（P<0.0001）富集分數顯著高于低IPTS患者。此外，在高IPTS組和低IPTS組中，抗腫瘤免疫和促腫瘤免疫的富集分數之間均存在顯著相關性（圖4D）。高分組相關系數為0.86 （P=5.1e?89），低分組相關系數為0.90 （P=1.8e?73）。此外，除CD56 bright NK細胞外（P=0.07），高IPTS組TIICs的富集分數顯著高于低IPTS組（P <0.0001，圖4E）。因此，基于IPTS的分子分型可替代NMF分型，具有潛在的臨床應用治療價值。由于預測模型是基于影響患者OS和DFS的基因構建的，因此通過生存分析來評估該模型的預后預測價值。此外，作者又評估了該模型是否能夠彌補NMF分型缺失的預后預測功能。結果顯示，當以最優截斷值代替ROC曲線的截斷值時，低IPTS組的OS （HR=1.06, 95% CI= 0.98-1.16, P=0.03，圖4F）和DFS （HR=1.12, 95% CI= 1.03-1.20, P=0.0027，圖4G）均優于高IPTS組。該預測模型能在一定條件下預測患者的預后。

圖4基于IPTS預測模型的分子分型可替代NMF分型

6. 免疫浸潤預測模型預測免疫治療的免疫療效和5種抗腫瘤藥物的潛在治療價值

在接受抗PD-1抗體免疫治療的NSCLC隊列（GSE126044）中，對免疫治療有反應的患者的IPTS明顯高于對免疫治療無反應的患者（P=0.0032）（圖5A），ROC曲線下面積為0.95 （95% CI= 1.00-0.84），而PD-L1的ROC曲線下面積為0.73 （95% CI= 0.99-0.46，圖5D），表明在本數據集中，IPTS對免疫治療的療效有很大的預測作用。在另一個NSCLC隊列（GSE135222）中，受益于免疫治療的患者IPTS高于未受益于免疫治療的患者（P=0.0451）（圖5B）， ROC曲線下面積為0.77 （95% CI= 0.96-0.58），也大于PD-L1的0.69 （95% CI= 0.90-0.48，圖5E），提示IPTS對該隊列的免疫治療療效具有良好的預測價值。此外，該數據集報告了患者PFS的預后信息。取最佳截斷值（IPTS=?2.13），高IPTS患者免疫治療后的PFS優于低IPTS患者（HR=0.72, 95% CI= 0.5-1.04, P=0.0059，圖5G），也表明免疫治療療效有較好的預測價值，對生存預后有一定的預測價值。有反應組患者的IPTSE明顯高于無反應組（P=0.0325）（圖5C）， ROC曲線下面積為0.88 （95% CI= 1.00-0.66），大于PD-L1的0.64 （95% CI= 1.00-0.26，圖5F）。取最佳截斷值（IPTS=?4.05），高IPTS患者經免疫治療后的PFS優于低IPTS患者（P=0.0403，圖5H）。由此可以證實，所構建的免疫浸潤預測模型對免疫療效具有預測價值，即高IPTS患者的免疫治療效果可能更好。

從上述分析來看，低IPTS患者不太可能從免疫治療中獲益。對于這一亞型的患者，作者通過GDSC數據庫初步篩選了其他可能有療效的抗腫瘤藥物。分析結果顯示，在LUSC細胞系中，高IPTS組的acetalax （P=0.0168）、AZD2014 （P=0.0416）、GSK2606414 （P=0.0145）、obatoclax mesylate （P=0.0061）、VSP34_8731 （P=0.0163） 5種抗腫瘤藥物的IC50均高于低IPTS組（圖5I）。此外，從熱圖（圖5J）可以看出，高IPTS組的IC50值普遍高于低IPTS組，說明低IPTS組患者對這五種藥物可能更為敏感。

圖5免疫浸潤預測模型預測免疫治療相對于5種抗腫瘤藥物的免疫療效

7. IPTS與免疫微環境評分和免疫相關基因特征表達呈正相關

采用IPTS分子分型分組分析法評估訓練集中501例LUSC患者的免疫微環境評分。結果顯示，高IPTS組間質評分（p0.0001）、免疫評分（p0.0001）和ESTIMATE評分（p0.0001）均顯著高于低IPTS組（圖6A），提示高IPTS組間質細胞水平和免疫細胞浸潤水平高于低IPTS組。同時，IPTS分子分型相關分析顯示，只有免疫評分在低IPTS組中具有統計學意義，基質評分和ESTIMATE評分在低IPTS組無顯著差異，提示三種免疫微環境評分在高IPTS組中主要與IPTS呈正相關。IPTS分子分型分析結果顯示，高IPTS組的趨化因子、受體、MHC分子、免疫抑制劑、免疫刺激因子富集分數明顯高于低IPTS組（圖6B）。分析四種免疫抑制劑CTLA-4、PD-1 （PDCD1）及其兩種配體PD-L1 （CD274）和PDL-2 （PDCD1LG2）在訓練集中IPTS組間表達值的差異。結果顯示，CTLA-4、PD-1、PD-L2在高IPTS組表達明顯高于低IPTS組，PD-L1表達不顯著（P=0.22）（圖6C）。IPTS分子分型相關分析結果顯示，在低評分組PD-1表達與IPTS呈顯著負相關（圖6H），而其他三種免疫抑制劑的表達均無統計學意義。在高評分組，四種免疫抑制劑CTLA-4、 PD-1、PD-L1、PD-L2與IPTS呈正相關（圖6G-J）。上述結果在一定程度上進一步為高IPTS患者獲得更好的免疫治療效果提供了理論依據。

圖6 IPTS與免疫微環境評分和免疫相關基因簽名表達呈正相關

8. 高IPTS參與免疫相關信號通路

GSEA結果顯示，IPTS主要與帕金森病、氧化磷酸化、亨廷頓病、阿爾茨海默病、剪接體、同源重組、核苷酸切除修復等相關（圖7A）。相反，高IPTS主要與細胞因子-細胞因子受體相互作用、趨化因子信號通路、自然殺傷細胞介導的細胞毒性、白細胞跨內皮遷移、利什曼原蟲感染、細胞粘附分子、JAT - STAT信號通路等有關（圖7B）。這些結果表明，低IPTS主要參與疾病、遺傳和代謝相關信號通路，而高IPTS主要參與免疫相關信號通路。

圖7高IPTS參與免疫相關信號通路

結論：

綜上所述，基于TCGA數據庫的生物信息學分析，構建了包含17個基因的LUSC患者免疫治療效果預測模型。在GEO數據庫的兩個獨立隊列中驗證了該模型的預測效果。IPTS分子分型與腫瘤免疫細胞浸潤程度呈正相關，與免疫治療療效呈正相關，具有潛在的預后價值。該研究為預測LUSC免疫治療的療效提供了一種新的方法，具有潛在的臨床前景.

參考文獻：

Yang L, Wei S, Zhang J, Hu Q, Hu W, Cao M, Zhang L, Wang Y, Wang P, Wang K. Construction of a predictive model for immunotherapy efficacy in lung squamous cell carcinoma based on the degree of tumor-infiltrating immune cells and molecular typing. J Transl Med. 2022; 20（1）:364. doi: 10.1186/s12967-022-03565-7.