N⁶ -甲基腺苷（m⁶A）是最常見的RNA修飾被認為是結直腸癌（CRC）重要的上轉錄機制癌癥。結直腸癌是全球范圍內癌癥發病率和死亡率的主要原因之一。本研究目的是探索腫瘤內生性m6A修飾是否以及如何驅動通過甲基轉移酶樣3 （METTL3）介導CRC的免疫結構。結果證實，在CRC細胞中METTL3的沉默可以減少MDSCs積累，最終抑制ApcMin/+Mettl3+/-小鼠、CD34+人源化小鼠和同基因的小鼠模型中CD4+和CD8+ T細胞的活化和增殖。這項研究強調，在結直腸癌中靶向METTL3可提高ICB治療結直腸癌的療效。本研究于2022年6月發表在《Gastroenterology》IF: 33.883期刊上。

技術路線：

主要研究結果：

1、  METTL3缺失可抑制結直腸腫瘤的發生，減少MDSCs積累

與野生型同窩小鼠相比，在ApcMin/+小鼠模型7中，METTL3雜合敲除小鼠（METTL3+/ -）的腫瘤明顯減少。結果表明，METTL3耗盡顯著降低了MDSCs，但增加了CD4+和CD8+ T細胞（圖1A和1B），推斷在METTL3缺失時抗腫瘤活性提高。一致地，ApcMin/+Mettl3+/-小鼠結腸組織中通過免疫組化（IHC）染色與ApcMin/+小鼠比較，發現CD8+細胞水平較高（圖S1C）。為了解免疫反應的改變，研究對ApcMin/+和ApcMin/+Mettl3+/-小鼠結腸組織中炎性細胞因子的表達趨化因子及其相應的受體。METTL3耗盡抑制促炎細胞因子IL6、TNF-α、C4B、CXCL1、NOS2和IL1B mRNA表達（圖1C）。通過附加的ApcMin/+和qPCR驗證了這一點ApcMin/+Mettl3+/-小鼠樣本（圖1D）。研究進一步采集外周血單核細胞（PBMCs）用于細胞因子23-Plex免疫測定（圖1E）。值得注意的是， CXCR2配體、MDSCs關鍵趨化因子CXCL1的血清水平為與ApcMin/+小鼠相比，ApcMin/+Mettl3+/-小鼠顯著降低（P< .05，圖1 F）。因此，METTL3可以調節抗腫瘤免疫。

圖1 METTL3可以調節抗腫瘤免疫。

2、  METTL3敲除可誘導CRC異體移植物抗腫瘤免疫反應

為了驗證METTL3在抑制CRC抗腫瘤免疫中的潛在作用，作者用CRISPRCas9敲除CT26和MC38兩種小鼠CRC細胞系中的METTL3 （M3KO） （圖2A）。MC38-M3KO同種異體移植瘤體積和重量顯著高于對照組與MC38-NC組相比降低（圖2B）。通過分析免疫細胞在腫瘤、PBMC和脾臟中，研究觀察到抗腫瘤免疫增強在攜帶MC38-M3KO同種異體移植的小鼠中，MDSCs顯著減少，特別是粒細胞樣MDSC （G-MDSC）伴CD4+和CD8+ T升高細胞（圖2）。此外，觀察到增加的干擾素γ （IFN-γ）+和腫瘤壞死MC38-M3KO異體移植物中因子α （TNF-α）+ CD8+ T細胞增加細胞毒性t細胞活化（圖2E）。為了證明研究的發現，接下來建立了原位結直腸癌模型。小鼠接受右旋糖酐鈉治療在MC38細胞定植前誘導一過性結腸損傷。通過活體嚙齒動物結腸鏡檢查，確定MC38同種異體移植物接種成功（圖2 G）。沉默METTL3可顯著降低腫瘤數量和腫瘤負荷在小鼠結腸中（圖2H）。此外，小鼠體內存在MC38-M3KO與對照組小鼠相比，同種異體移植小鼠PBMC中的MDSCs顯著減少（圖2）。研究結果共同表明METTL3缺失增強抗腫瘤免疫抑制CRC生長。

圖2  沉默METTL3可恢復抗腫瘤免疫。

3、表達METTL3的CRC細胞通過分泌CXCL1招募MDSC

為了揭示METTL3促進CRC免疫抑制的機制，對MC38-NC和MC38-M3KO細胞進行RNA-seq（圖3A）。在MC38敲除METTL3后，1612個基因表達下調，1428個基因表達下調上調（圖3A）。值得注意的是，敲除METTL3與下調白細胞跨內皮遷移和細胞因子-細胞因子受體相互作用途徑可能與癌癥或免疫細胞相互作用有關（圖3B）。基因中細胞因子-細胞因子受體相互作用途徑，CXCL1、CXCL10顯著降低和CCL2在MC38-M3KO細胞中表達（圖3C） qPCR也證實METTL3敲除抑制CT26和MC38細胞中CXCL1、CXCL10和CCL2 mRNA的表達（圖3D）。相反，CT26中METTL3的異位表達起到相反的作用（圖3E）。在APCmin/+Mettl3+/-組血清CXCL1水平顯著降低與APCmin/+小鼠比較（圖1F）。ELISA檢測結果表明敲除METTL3可顯著減少細胞培養上清中CXCL1的分泌在CT26和MC38細胞中（圖3F），以及在含有CT26和MC38細胞的小鼠血清中MC38同種異體移植（圖3G）。因此，METTL3促進CRC中CXCL1的表達。CXCL1是趨化刺激因子通過與受體CXCR2結合，將MDSC招募到腫瘤微環境中。因此，推測METTL3可以通過CXCL1的分泌促進MDSCs的招募。

圖3  METTL3通過CXCL1-CXCR2軸招募MDSCs。

4、METTL3在CRC中促進m⁶A-BHLHE41驅動CXCL1轉錄

METTL3是m6A甲基化的主要甲基轉移酶。闡明METTL3依賴的m6A修飾與CXCL1表達之間的聯系，m6A-seq是在MC38-NC和MC38-M3KO細胞中進行（圖4A）。研究檢測到9477和9092m6A峰值分別出現在MC38-NC和MC38-M3KO中，主要位于編碼區序列區（CDS）和三素數非翻譯區（3 ' -UTR）密度較大停止密碼子周圍的峰值（圖4B）。m6A以GGAC為標識（圖4 B）。這些潛在的METTL3靶點是在多種信號通路中富集，尤其是在DNA轉錄方面（圖4C）。因此，通過RNA-seq鑒定，因此，通過RNA-seq鑒定，METTL3敲除細胞中有1612個下調轉錄本用于Pscan識別149個過代表轉錄因子（RNA-seq）和289個METTL3靶點（m6A-seq）縮小到5個候選（圖4D）， BHLHE41， ETS1， REST， SP4和YY1（圖4 E）。MeRIP-qPCR證實他們的m6A水平顯著降低在CT26和MC38細胞中敲除METTL3后（圖4F）。此外，基因敲除METTL3抑制CT26和MC38細胞BHLHE41蛋白表達；而ETS1和YY1蛋白水平保持不變（SP4檢測不到）（圖4G）。因此，BHLHE41是METTL3潛在的下游靶點。CT26細胞中METTL3的異位表達增加了BHLHE41蛋白表達式（圖4 G）。接下來詢問BHLHE41是否與Cxcl1啟動子結合以介導其轉錄。ChIP-PCR實驗結果顯示BHLHE41可以直接結合Cxcl1的啟動子區域（圖4 H）。最終，BHLHE41的敲除廢除了推廣METTL3對MDSC遷移的影響（圖4J）。這些數據共同表明在CRC細胞中，METTL3促進m6A-BHLHE41驅動CXCL1轉錄。

圖 4  METTL3可以促進CRC中BHLHE41蛋白表達。

5、METTL3驅動的MDSC積累抑制T細胞增殖促進CRC增長

接下來，作者研究MDSC對表達METTL3的CRC T細胞的抑制能力微環境。從CT26同種異體移植物中分離出CD11b+Gr-1+ MDSCs，然后在體外與T細胞以不同比例共培養（圖5A）。此外，參與MDSC抑制功能的基因表達，包括ARG1，S100A9和TGFB1在METTL3缺失的MDSCs中顯著降低CT26異體移植（圖5D）?？笹r -1抗體顯著耗盡MDSCs，消除METTL3在CT26同基因模型中的促腫瘤作用（圖5 E）。同樣，CXCR2抑制劑SB265610也能有效地消除METTL3的誘導作用MDSC募集和CRC異體移植在體內的生長（圖5F）。研究得出結論，METTL3驅動MDSC積累和抑制效能促進結直腸癌的生長。

圖 5  METTL3可招募抑制性MDSC促進CRC。

6、在人源化免疫系統小鼠模型中METTL3的缺失可以增強抗腫瘤免疫并降低CRC的生長

為了證實METTL3在調節人抗腫瘤免疫應答中的作用，CD34+采用人源化小鼠模型在小鼠體內復制人體免疫系統。免疫缺陷NSG小鼠靜脈注射人CD34+造血干細胞亞致死γ照射后的干細胞（圖6A）。流式細胞術證實在小鼠接種腫瘤之前，人CD45+細胞包含>25%的PBMCs（圖6 B）。皮下注射METTL3敲除或未敲除的HCT116細胞植入（圖6C）。研究觀察到METTL3缺失對HCT116腫瘤有抑制作用在CD34+人源化小鼠中生長（圖6D），而在CD34+人源化小鼠中效果不明顯非人性化NSG小鼠。接下來，作者比較了免疫的浸潤情況METTL3敲除或不敲除HCT116腫瘤組織中的細胞（圖6E），METTL3的消耗導致MDSC減少，尤其是G-MDSC的顯著降低，隨著CD4+和CD8+ T細胞的增加（圖6F），證實了作者的發現METTL3誘導CRC的抗腫瘤免疫反應。此外，在HCT116腫瘤中敲除METTL3顯著抑制BHLHE41（圖6G）和CXCL1（圖6H）蛋白表達。最后，METTL3蛋白表達為與原發性人結直腸癌組織中CD33+ MDSCs浸潤顯著相關（圖6I）?？傊琈ETTL3的沉默增強了抗腫瘤免疫抑制結直腸癌生長。

圖 6  敲除METTL3誘導抗腫瘤免疫，可以抑制結直腸癌在人源化小鼠模型中生長。

7、靶向METTL3增強抗PD -1治療抑制結直腸癌的效果

鑒于METTL3招募抑制性MDSC來促進CRC的免疫抑制，作者下一步研究了在CRC中靶向METTL3是否可以提高ICB的療效治療。為此，使用antiPD-1處理對照和METTL3敲除MC38異體移植物。研究發現，METTL3敲除或單獨抗PD -1治療與對照相比都能降低腫瘤尺寸和重量（圖7A，7B）。重要的是，他們對MC異體移植物具有較強的抑制作用腫瘤緩解率60%（6 / 10）（圖7A, 7B）。PBMC浸潤MDSCs的豐度，尤其是G-MDSC，以及血清CXCL1顯著增加METTL3敲除+抗PD -1處理MC38異體移植減少（圖7C和7 D）。接下來，作者評估了對METTL3的藥理抑制是否可以達到同樣的效果的效果。STM2457是一種高效、選擇性的METTL3抑制劑。同樣，PBMC浸潤MDSC和血清在STM2457加抗PD -1處理后CXCL1明顯減少（圖7G和7 H）。相反，在MC38同種異體移植物中，活化T細胞浸潤率最高（圖7I和7J）。綜上所述，研究數據發現METTL3是CRC的潛在治療靶點，其抑制可恢復抗腫瘤免疫，增強ICB治療的療效。

圖 7  使用抗PD -1聯合METTL3抑制CRC。

綜上所述，研究證明了RNA m6A甲基轉移酶的作用和機制，METTL3在CRC中抑制宿主抗腫瘤免疫應答。METTL3促進m6A-BHLHE41-CXCL1/CXCR2軸招募免疫抑制MDSCs抑制CD8+ T細胞，從而促進CRC。METTL3抑制加上抗PD-1表現了對CRC具有良好的抗腫瘤作用，強調METTL3在CRC治療中是一個潛在的目標。

參考文獻：

Chen H, Pan Y, Zhou Q, Liang C, Wong CC, Zhou Y, Huang D, Liu W, Zhai J, Gou H, Su H, Zhang X, Xu H, Wang Y, Kang W, Kei Wu WK, Yu J.（2022）.METTL3 inhibits anti-tumor immunity by targeting m6A-BHLHE41-CXCL1/CXCR2 axis to promote colorectal cancer. Gastroenterology, undefined (undefined), undefined. doi: 10.1053/j.gastro.2022.06.024.