大量研究表明DNA甲基化改變與癌癥進展之間的關系，但只有少數基因被證實可作為結直腸癌（CRC）的診斷生物標志物。近日，有研究發現PDX1, EN2和MSX1的高甲基化可以預測結直腸癌患者的預后，該研究發表在《Experimental & Molecular Medicine》，IF：12.125。

技術路線：

主要研究結果：

1. 通過靶向亞硫酸氫鹽測序鑒定CRC組織中的差異甲基化區域

為了觀察CRC和其他類型癌癥中的甲基化水平，從TCGA收集了5種癌癥類型（COAD、READ、LIHC、AD和PAAD）的微陣列數據（圖1a）。根據人類基因組ref. （hg19）將每個CpG位點的beta值取平均值，以代表其匹配的CpG島的甲基化值。根據一下標準進一步過濾所選擇的CpG島：健康組織和腫瘤組織之間的甲基化值差異應該大于20%； 20%的癌癥患者應該存在這種差異。最終獲得了10,754個差異甲基化的CpG島（圖1b）。作者使用NimbleDesign軟件設計選定的CpG島來探測池 （圖1c）。

從104例韓國CRC患者的組織中獲得了基因組DNA，根據制造商說明書制備靶向亞硫酸氫鹽測序文庫（圖1d）。為了識別一些患者不特異的差異甲基化區域，在計算健康組織和腫瘤組織的總體平均值后，選擇差異超過30%的區域（圖1e）。最終在腫瘤組織中鑒定出40個差異甲基化的CpG島，包括35個高甲基化區域和5個低甲基化區域。健康組織中平均甲基化水平為29%，腫瘤組織中為78.7%，在83.3%的CRC患者中觀察到這種差異（表1）。

圖1結直腸癌隊列特異性DNA甲基化生物標志物選擇的總體流程

表1列出了從90例結直腸癌患者的靶向亞硫酸氫鹽測序數據中選擇的候選CpG島及其匹配的基因，并提供了有關CpG島及其鄰近基因的基因組和功能位置信息。

2. 候選基因的選擇，以發展結直腸癌生物標志物

根據啟動子、基因內和基因間區域觀察40個差異甲基化CpG島的位置時，作者觀察到在腫瘤的35個高甲基化區域中，16個CpG島位于啟動子區域，18個位于基因內區域，1個位于基因間區域。在5個低甲基化區域中，1個在啟動子區域，4個在基因內區域（圖2a和表1）。此外，在18個高甲基化的基因內區域中，有7個基因（PDX1、GRIN2D、PITX1、TFAP2A、EN2、MSX1和NR2E1）在腫瘤中表達增加了2倍以上（圖2b）。為了確定這7個基因的上調水平，作者還在TPM值上檢查了其他候選基因的表達，然后剔除了NR2E1，因為它缺乏統計學意義（圖2c）。此外，相關性檢測分析發現PDX1、EN2和MSX1在腫瘤中的表達水平高于正常組織，且甲基化和表達水平呈正相關（圖2b、c）。通過檢測基因的表達與CRC患者生存率之間的關系，發現PDX1、EN2、MSX1的高表達與患者生存呈負相關（圖2d）。因此，后續決定集中研究這三個基因。

圖2基于差異基因表達及其與CRC患者生存結局相關性的候選DNA甲基化生物標志物基因

3. PDX1、EN2或MSX1過表達促進人結腸癌細胞增殖和侵襲

功能分析實驗表現，過表達PDX1、EN2和MSX1增加了癌細胞增殖（圖3a），顯著促進HCT116細胞的遷移（圖3b），這些結果表明PDX1, EN2和MSX1的過表達與CRC細胞的增殖和遷移直接相關。因此，作者推測如果這些基因的基因內區域的甲基化變化與基因表達的變化相關，那么檢測標記區域的甲基化變化將能夠預測細胞狀況。

圖3篩選出的候選DNA甲基化生物標志物基因通過促進細胞增殖和遷移來驅動體外致癌特性

4. 設計MSP引物以最佳檢測甲基化變化

為了設計針對PDX1基因內CpG島的MSP引物，作者檢測了該區域80個單個CpG位點的甲基化變化。雖然大多數CpG位點在腫瘤組織和健康組織之間的甲基化變化有很大差異，但最終根據候選CpG島中每個CpG位點的甲基化水平的熱圖和線形圖設計了MSP引物（圖4a）。PDX1正向引物有4個CpG位點，反向引物有3個CpG位點。這7個CpG位點的β值在正常組織中約為10%，而在腫瘤組織中平均為70%。擴增子大小為126 bp和123 bp, Tm為55-57℃（圖4a）。EN2的正向引物和反向引物都有三個CpG位點。6個CpG位點的β值在正常組織中約為10%，而在腫瘤組織中平均為70%。擴增子大小分別為127 bp和112 bp, Tm為57-58℃（圖4b）。MSX1正向引物和反向引物均有3個CpG位點。6個CpG位點的β值在正常組織中約為10%，而在腫瘤組織中平均為70%。擴增子大小分別為151 bp和144 bp, Tm為55-57℃（圖4c）。

圖4甲基化特異性PCR （MSP）中引物結合位點選擇和引物設計的優化基準

5. MSP引物可有效檢測感興趣區域的甲基化狀態

在每個CpG島，甲基化引物在SW480、LoVo和HCT116細胞中均產生PCR產物，而在CCD-18Co細胞中未產生PCR產物。相反，在CCD-18Co細胞中檢測到未甲基化的引物，而在SW480、LoVo和HCT116細胞中未檢測到。半甲基化引物未能在CCD-18Co、SW480、LoVo和HCT116細胞中顯示出明顯的差異（圖4d-f）。當我們作者甲基化引物時，SW480、LoVo和HCT116細胞的甲基化水平顯著高于CCD-18Co細胞，而使用半甲基化引物時則沒有（圖4d-f）。此外，通過qMSP觀察了CCD-18Co和SW480細胞的差異甲基化水平，發現對于PDX1，即使是0.5 ng的模板DNA也足以觀察到這種差異（圖4g-i）。從這些結果證實了MSP引物可以非常有效地區分癌細胞和正常細胞。

6. 建立的MSP引物可以檢測甲基化狀態的動態變化

為了檢測MSP引物是否可以區分甲基化水平的動態變化，作者使用CRISPR/dCas9-TET1系統（dCas9-TET系統）以位置特異性的方式降低甲基化水平（圖5a）。在將dCas9-TET系統引入PDX1基因組區域后，使用包含7個CpG位點的甲基化引物檢測到甲基化水平顯著降低。然而，半甲基化引物無法檢測到這一差異（圖5b）。隨著基因內區域甲基化水平的降低，PDX1的表達顯著降低，表明甲基化的變化與基因表達的變化直接相關（圖5c），且EN2和MSX1得到了相似的結果。使用甲基化引物，能成功檢測到EN2和MSX1基因內區域的甲基化水平降低，這與基因表達的降低一致（圖5d-g）。因此，甲基化引物可以檢測到在基因表達變化之前發生的甲基化變化。

圖5定制的MSP引物檢測由CRISPR/dCas9-gRNA系統調控的SW480候選生物標志物的甲基化變化

7. PDX1、EN2和MSX1的甲基化水平預測結直腸癌轉移

接下來，作者研究了PDX1、EN2和MSX1的基因內CpG區域的甲基化水平是否具有臨床意義。作者利用曼哈頓距離進行層次聚類，根據這些區域的甲基化水平對患者進行分類，得到兩個組：高甲基化組（組1,N = 26），中間甲基化和低甲基化組（組2,N = 61）（圖6a）。這兩組在OS（圖6b）和PFS率（圖6c）方面存在顯著差異。此外，周圍淋巴、血管和神經侵犯是腫瘤轉移后的特征性事件，這些事件在組1中發生率高于組2。然而，未觀察到細胞分化、微衛星不穩定性和腫瘤位置的差異，因為大多數IV期（轉移后）患者被納入組1，而大多數III期（轉移前）患者被納入組2（表2）。這些結果表明，PDX1, EN2和MSX1甲基化水平可以預測CRC患者的預后。

最后，研究MSP系統是否可以區分這兩個患者組。與組2中的5例患者相比，組1中的2例患者在PDX1、EN2和MSX1的基因內區域顯示出更高的甲基化水平（圖6d）。該結果表明，MSP檢測系統可用于臨床預測結直腸癌患者的預后和術后轉移。

圖6通過對CRC患者的分類顯示了3個基因甲基化標簽的預后潛力

表2 根據PDX1、EN2和MSX1基因內CpG島甲基化水平分組，收集臨床資料

結論：

在這項研究中，作者提出了一種識別CRC預后標志物的實用方法。作者利用公共數據庫并生成合適的高深度靶向亞硫酸氫鹽測序數據來定義韓國東南部特異性差異甲基化區域（DMRs）。此外，在體外驗證了PDX1, EN2和MSX1基因內CG基因的增殖能力，并提出了優化的qMSP方法，以進一步應用于臨床領域。基于隊列患者的隨訪數據，作者發現靶向CGI高甲基化的CRC患者的OS顯著降低，復發率較高。除了手術活檢、輔助化療和其他適當治療外，定期追蹤預后因素可能對晚期CRC患者有幫助。