硅藻是單細胞藻類，其細胞壁為硅質。這些二氧化硅元素在膜結合的二氧化硅沉積囊泡中在細胞內形成，并在完成后被胞吐。硅藻在這些大而硬的二氧化硅介質的胞吐過程中如何維持膜穩態仍然未知。本文利用活細胞共聚焦顯微鏡、透射電鏡和冷凍電子斷層掃描技術，研究了兩種硅藻模型物種的細胞壁形成和胞吐。結果表明，在其形成過程中，礦物相與二氧化硅沉積囊泡膜緊密結合，形成了精細幾何圖案的精確模具。在胞吐過程中，遠端二氧化硅沉積囊泡膜和質膜逐漸與礦物分離，并在細胞外空間分解，沒有任何明顯的內吞回收或細胞外再利用。在細胞內，近端二氧化硅沉積囊泡膜成為細胞與其環境之間的新屏障，并承擔了新的質膜的作用。這些結果提供了硅藻二氧化硅胞吐的直接結構觀察，并指出了一種非凡的機制，其中膜穩態是通過丟棄而不是回收，重要的膜補丁來維持的。本文于2023年1月發表于Nature Communications (IF=17.694)。

技術路線：

主要研究結果：

(1) S. turris和T. pseudonana的形態學研究

我們通過研究兩種硅藻S. turris和T. pseudonana，研究了硅藻的瓣膜胞吐(圖1)。S. turris的瓣膜呈囊狀，有兩層結構。近端層很薄，被納米級孔穿孔，遠端層被更高的層覆蓋，形成大的多邊形(圖1a’,a”)。多邊形層的頂部被壓平，在截面上形成“T”形(圖1a”’)。S. turris細胞形成鏈，通過從瓣膜頂端延伸的管狀連接二氧化硅延伸連接(圖1a，箭頭)。T. pseudonana細胞呈桶狀，體積小得多，閥瓣為直徑約5 μm(圖1b)。在徑向肋之間的硅層上有小孔，而較大的管狀孔裝飾著閥門的邊緣(圖1b’,b”)。圖1e,f顯示了在瓣膜形成期間和之后不久細胞的分裂。新形成的閥門用PDMPO染色，PDMPO是一種熒光染料，在生物礦化過程中摻入二氧化硅。將細胞大小與成熟瓣膜在胞吐前的大小進行比較，說明了這些堅硬的二氧化硅細胞壁胞吐所涉及的巨大挑戰(圖1g,h)。

圖1：S. turris和T.pseudonana的細胞結構

(2) S. turris膜和二氧化硅動力學的活細胞成像

我們使用活細胞的延時共聚焦顯微鏡研究了S. turris的膜動力學(圖2)。在硅化過程中，PDMPO和FM4-64信號幾乎共定位到共聚焦顯微鏡的分辨率(圖2a)。這表明質膜和SDV內不斷增長的二氧化硅結構之間非常接近，即質膜襯SDV形狀。然而，連接延伸部分的生長尖端僅用膜染料染色，這表明SDV伸長先于其最邊緣部分的硅化(圖2a，箭頭)。

我們記錄了S. turris細胞在瓣膜形成和胞吐的整個過程中的膜動態延時(圖2b)。通過熒光質膜可見瓣膜形成的過程，勾勒出不斷增長的多邊形二氧化硅層和連接延伸部分(圖2b, t=0到t=126)。胞外作用的開始，即質膜-SDV-二氧化硅復合物的松動是明顯的，因為標記的質膜不再清晰地勾勒出多邊形(圖2b, t=132)。

連接擴展段周圍的FM4-64信號在其生長過程中是連續的，但在擴展段達到完全大小后，熒光信號變為間斷的斑塊，逐漸消失(圖2b, t=156和t=234)。在某些情況下，圍繞連接延伸的膜明顯不再連接到細胞體(圖2b’)。FM4-64只標記結構完整的膜，當膜被分解時，它將不再標記畸形的碎片。這些觀察指向了一種情況，遠端膜的主要部分完全脫離主細胞表面，逐漸解體，并在最近分裂的子細胞之間的細胞外空間失去熒光標記。

圖2：S. turris中的閥形成期間三維重建的時移共聚焦熒光圖像顯示協調二氧化硅和膜動力學

(3) S. turris中二氧化硅形成和胞吐的超微結構

為了在超微結構分辨率下觀察相同的過程，我們準備了分裂的S. turris細胞進行透射電鏡分析。S. turris細胞的透射電鏡圖像顯示，細胞環境的保存非常好，特別是SDV的膜和無機內容物(補充圖未展示)。

我們從227個細胞在細胞周期的不同階段獲得了數百張圖像，分類和排序后重建了S. turris中瓣膜形成和胞外分泌的時間軸(圖3)。具有含有生長瓣膜的SDV的細胞被歸類為處于瓣膜形成階段(n=61，圖3a-b”)。遠端SDV膜與質膜非常接近，距離僅為10-30nm(圖3a”，插圖)。在早期瓣膜形成期間，SDV僅延伸至硅沉積的深度(圖3a”)。多孔基層形成后，在其遠端形成多邊形層(圖3b-b”，箭頭)。當瓣膜仍然完全封閉在SDV中時，觀察到23個細胞，一個完整的SDV包含一個完全成熟的瓣膜(圖3c-c”)。

在68個細胞的圖像中，一個成熟的瓣膜被一些不連續的SDV膜包圍，即SDV沒有形成一個完整的外殼。我們定義這些細胞正在進行胞吐。這些膜的不連續可能是非常局部的，而大部分瓣膜仍然被SDV緊緊包圍(圖3d-d”)。遠端SDV和瓣膜周圍的質膜的緊密描繪松動，觀察到遠端膜的結構完整性惡化(圖3e-e”)。瓣膜近端膜現在與父瓣膜下的質膜連續(圖3e”，箭頭)。在胞吐過程結束時，由于其位于親本束帶下，可以識別出新的瓣膜，而在細胞質外看不到膜的可見痕跡(n=75，圖3f-f”)。

我們分析了新形成瓣膜附近的膜的顯微鏡數據，以確定可能與SDV膜回收有關的內吞膜回收的跡象。觀察到7例胞吐期細胞膜內陷的情況。這些內陷的大小從0.5-3 μm不等(補充圖未展示)。然而，這種內陷在瓣膜形成和胞吐的所有階段都有檢測，發生率相似(Χ²_{(df=2, N=152)}=2.23, p=0.327)，因此與胞吐后膜循環無關?？偟膩碚f，在瓣膜胞吐過程中，遠端膜在細胞外解體，沒有恢復的跡象，而新瓣膜近端唯一可見的膜是SDV膜近端。

圖3：透射電鏡圖像顯示了S. turris的瓣膜形成和胞吐的順序階段

(4) T. pseudonana中二氧化硅胞吐的原生態納米級結構

為了使細胞組織盡可能接近原生狀態，我們獲得了T. pseudonana細胞進行瓣膜胞吐的冷凍電子斷層掃描(cryo-ET)數據。使用驟降冷凍和聚焦離子束制備薄薄片，在低溫條件下收集電子層析圖，玻璃化同步T. pseudonana細胞。在59對成像的子細胞中，15對發生在瓣膜胞吐期間或后不久，即第一組束帶胞吐之前。其中4例發生在胞吐早期，新瓣膜僅部分被SDV膜覆蓋(圖4a-d)。

圖4a,c顯示了同對子細胞不同位置的斷層圖。左側的瓣膜仍然完全封閉在SDV內，而右側的瓣膜已經通過遠端膜覆蓋的不連續暴露在細胞外空間。在胞吐前的子細胞中，可以看到膜的預期排列：質膜覆蓋整個細胞，并緊密地覆蓋在SDV膜下面，完全包圍瓣膜(圖4a,b，左側)。然而，在胞吐過程中，遠端膜在多個部位融合，形成扁平膜囊網絡，使瓣膜近端膜成為細胞的最外層邊界(圖4a,b，右側)。在瓣膜周圍也觀察到類似的情況，在翼狀口遠端可見不相連的膜性結構(圖4c,d，右側)。

在8對處于胞吐后期的細胞中，位于兩個子細胞最近胞吐的瓣膜和它們的束帶之間的大膜性囊泡(圖4e)。在剩下的三對最近有胞外瓣膜的細胞中，兩個子細胞之間沒有囊泡或膜殘留物。然而，在這三個細胞中，親代束帶并沒有包圍子細胞，這表明細胞周期的后期，所有細胞外碎片都被降解了。沒有一個成像的細胞含有發芽的內吞囊泡或在瓣膜下形成新膜的跡象。低溫ET數據表明T. pseudonana使用與我們從S. turris收集的數據推斷的相同的胞吐機制，其中近端SDV膜被重新利用為新的質膜，遠端膜在細胞外分解(圖4f)。

圖4：細胞內冷凍ET顯示T. pseudonana瓣膜胞吐的原生狀態解剖

結論：

本文提出了硅藻二氧化硅胞吐的獨特機制。首先，細胞器膜被重新利用成為質膜，其次，膜的大規模分解。這一機制被兩種模式硅藻物種所共享，可能是一種普遍機制。隨著硅藻遺傳研究工具箱的增長，很快就有可能研究參與這一事件的調節的蛋白質機制，以及它與經典胞吐的關系。

參考文獻：

deHaan, D., Aram, L., Peled-Zehavi, H., Addadi, Y., Ben-Joseph, O., Rotkopf, R., Elad, N., Rechav, K., & Gal, A. (2023). Exocytosis of the silicified cell wall of diatoms involves extensive membrane disintegration. Nature communications, 14(1), 480. https://doi.org/10.1038/s41467-023-36112-z.