m5C修飾主要由RNA甲基轉移酶NSUN2誘導，是mRNA中重要的轉錄后化學修飾，已被證明在許多癌癥的進展中發揮重要作用。然而，NSUN2介導的m5C在骨肉瘤(OS)中的作用和潛在的分子機制尚不清楚。在本研究中，我們發現NSUN2在骨肉瘤組織和細胞中高表達。我們還發現NSUN2表達越高，OS患者預后越差。我們的研究表明NSUN2可以促進OS細胞的進展。通過RNA測序、RIP、甲基化RIP篩選驗證NSUN2的候選靶點，確定FABP5為靶點。我們觀察到NSUN2通過誘導m5C修飾穩定FABP5 mRNA，并進一步促進OS細胞的脂肪酸代謝。此外，下調FABP5表達和添加脂肪酸氧化抑制劑均能抵消NSUN2對OS進展的促進作用。我們的研究證實NSUN2可以通過m5C提高FABP5 mRNA的穩定性，上調FABP5的表達，從而促進骨肉瘤細胞的脂肪酸代謝，最終起到促進骨肉瘤進展的作用。我們的研究結果表明，NSUN2是骨肉瘤患者有希望的預后標志物，并可能作為骨肉瘤治療的潛在治療靶點。本文于2023年2月發表于Cell Death and Disease（IF=9.685）上。

技術路線

結果

1）NSUN2在骨肉瘤細胞和組織中高表達

為了評估NSUN2在人類OS中的表達譜，我們分析了GEO數據庫中的數據，發現NSUN2在OS組織中高表達(圖1A,1B)。然后，我們分析來自UCSCXENA的TARGET-OS中的轉錄組數據和相應的生存信息，發現NSUN2表達越高，OS患者預后越差(圖1C)。此外，我們采用逆轉錄qPCR (RT-qPCR)、免疫組化(IHC)和免疫印跡(western blot)方法檢測了正常和骨肉瘤腫瘤組織中NSUN2的表達。RT-qPCR(圖1D)、IHC(圖1E)和western blot(圖1F)結果顯示NSUN2在OS組織中表達較高。根據NSUN2 IHC評分，23個腫瘤組織被鑒定為“高”(47.92%)，22個腫瘤組織被鑒定為“中”(45.83%)，3個腫瘤組織被鑒定為“低”(6.25%)；5個正常組織鑒定為“高”(10.41%)，11個正常組織鑒定為“中”(22.92%)，32個正常組織鑒定為“低”(66.67%)。這些結果的統計圖如圖1E所示。此外，NSUN2在骨肉瘤細胞系(143b, MG63, U2)中的表達也高于骨間充質干細胞(BMSCs)和人成骨細胞(hbb1.19)(圖1G, H)。綜上所述，所有這些結果提示NSUN2在OS中上調，且NSUN2高表達與不良預后相關。

2）NSUN2缺乏顯著抑制體外骨肉瘤的進展

為了闡明NSUN2在OS進展中的功能作用，我們選擇143b和U2細胞系進行進一步研究。我們使用shNSUN2#1和sh-NSUN2#2生成穩定的NSUN2敲除OS細胞系，然后檢測這些細胞的增殖、侵襲和遷移能力。RT-qPCR和western blot結果顯示，sh-NSUN2#1和sh-NSUN2#2顯著降低了143b細胞(圖2A、B)和U2細胞(圖2C、D)中NSUN2的表達。CCK-8和集落形成實驗表明，NSUN2缺乏降低了143b細胞和U2細胞的增殖能力(圖2E-G)。為了檢測骨肉瘤細胞的侵襲和遷移能力，我們進行了傷口愈合和transwell實驗。結果證實敲除NSUN2后，143b和U2細胞的侵襲能力(圖2H)和遷移能力(圖2I)下降。總的來說，這些結果表明，在體外敲除NSUN2表達對骨肉瘤的進展有負面影響。

3）NSUN2缺乏可抑制OS細胞在體內的增殖

我們用穩定轉染sh-NSUN2#1或sh-ctrl的143b細胞和U2細胞在裸鼠中生成腫瘤異種移植。我們將穩定轉染的OS細胞接種于裸鼠左脛骨上段，觀察腫瘤大小3周。接下來，我們犧牲所有裸鼠，并收集左腿進行微計算機斷層掃描(micro-CT)。此外，我們收集并稱重所有腫瘤。正如預期的那樣，sh-NSUN2#1組腫瘤的最終大小小于sh-ctrl組(圖3A-D)。此外，微CT掃描的結果顯示sh-NSUN2#1組左腿骨破壞較輕，腫瘤體積較小(圖3E, G)。此外，sh-NSUN2#1組腫瘤重量較輕(圖3F、H)。IHC結果證實NUSN2和Ki- 67的表達在sh-NSUN2 # 1組腫瘤中降低(圖31)。上述結果表明，NSUN2缺乏抑制OS細胞體內的增殖。

4）FABP5是NSUN2的潛在靶點

為了確定OS細胞中NSUN2的下游靶點，我們對穩定轉染shNSUN2#1或OE-NSUN2的143b細胞進行RNA-seq。我們重點研究了與NSUN2表達水平呈正相關或負相關的基因(圖4A)，并制作了包含所有這些基因的兩張熱圖(圖4B)。從熱圖中，我們得出結論，FABP5在“shNSUN2 VS sh-ctrl”和“OE-NSUN2 VS OE ctrl”中表達變化最顯著。因此，我們推測FABP5是NSUN2在骨肉瘤細胞中的潛在靶點，且NSUN2通過調控FABP5的表達促進骨肉瘤的進展。為了驗證我們的假設，我們在穩定轉染的143b和U2細胞中，用RT-qPCR檢測了FABP5 mRNA的表達水平，發現敲低NSUN2時，FABP5 mRNA的表達水平明顯下降(圖4C, F)，過表達NSUN2時，FABP5 mRNA的表達水平升高(圖4D, G)。western blot結果也證實，敲低NSUN2時FABP5蛋白表達水平下降，過表達NSUN2時FABP5蛋白表達水平升高(圖4E, H)。為了確定NSUN2是否通過直接或間接作用影響FABP5的表達，我們采用RIP法檢測NSUN2蛋白是否能與FABP5 mRNA結合。結果顯示，我們從143b和U2細胞中分離出的RNA中含有FABP5 mRNA(圖4I, J)，說明NSUN2蛋白可以直接與FABP5 mRNA結合。以上結果表明，NSUN2蛋白可以直接靶向FABP5 mRNA，影響FABP5的表達水平。為了進一步驗證我們的猜想，我們用RT-qPCR檢測了我們采集的骨肉瘤組織和正常組織中FABP5 mRNA的表達，結果證實FABP5在骨肉瘤組織中也是高表達的(圖4K)。這一結果進一步支持了我們的猜想，FABP5是NSUN2在骨肉瘤細胞中的潛在靶點。

5）NSUN2通過m5C促進FABP5 mRNA的穩定性

為了進一步驗證NSUN2是否通過m5C調控FABP5的表達，我們構建了一個具有突變位點的NSUN2過表達質粒。前期研究證明NSUN2主要依靠C271和C321位點的兩個半胱氨酸發揮甲基轉移酶的作用。C321位點的半胱氨酸與胞嘧啶嘧啶環形成共價鍵，催化胞嘧啶甲基化，而C271位點的半胱氨酸介導甲基化RNA的釋放。因此，我們在NSUN2的C271位點將“TG”突變為“GC”，使原序列“TGC”突變為“GCC”。通過這種方法，我們在NSUN2的C271位點將半胱氨酸突變為丙氨酸。采用同樣的方法，我們還在NSUN2的C321位點將半胱氨酸突變為丙氨酸(圖5A)，然后將突變的NSUN2質粒轉染到143b和U2細胞中，用點印跡法檢測所有穩定轉染的細胞的m5C水平。我們發現sh-NSUN2導致m5C水平降低，而過表達NSUN2導致m5C水平升高(圖5B)。然而，轉移到突變NSUN2質粒的細胞m5C水平沒有任何變化(圖5B)。為了確認NSUN2是否可以調節FABP5 mRNA的m5C水平，我們對穩定轉染的143b和U2細胞進行了甲基化RIP實驗。m5C甲基化-RIP的結果顯示，過表達NSUN2可以促進143b和U2細胞FABP5 mRNA的m5C水平，而突變NSUN2則不能。環亮氨酸可降低143b和U2細胞FABP5 mRNA的m5C水平，并呈濃度依賴性(圖5C, D)。然后，我們用RT-qPCR檢測143b和U2細胞中NSUN2和FABP5的表達。結果證實MUT-NSUN2可以促進NSUN2的表達，但不能促進FABP5的表達。環亮氨酸可以降低FABP5的表達，而不降低NSUN2的表達(圖5E, F)。綜上所述，m5C水平越高，FABP5 mRNA的表達也越高。接下來，我們研究NSUN2介導的m5C如何調控FABP5 mRNA的表達。我們檢測放線菌素D (ActD, 5μg/ml)處理的143b和U2細胞中FABP5 mRNA的穩定性。結果表明，FABP5 mRNA的m5C水平越高，衰減到50%所需的時間越長，穩定性越好。也就是說，NSUN2可以通過m5C促進OS細胞中FABP5 mRNA的穩定性。此外，我們通過western blot檢測143b和U2細胞中FABP5蛋白的表達，發現FABP5 mRNA的m5C水平越高，FABP5蛋白的表達越高(圖5I, J)。

6）NSUN2促進骨肉瘤細胞脂肪酸代謝

眾所周知，FABP5在脂肪酸代謝中起著非常重要的作用。為了評估NSUN2是否能促進OS細胞的脂肪酸代謝，我們首先用BODIPY 493/503檢測穩定轉染的143b和U2細胞的中性脂質水平。結果表明，NSUN2過表達導致骨肉瘤細胞中性脂質的收縮。與NSUN2類似，FABP5過表達也會導致中性脂質減少，敲除可增加骨肉瘤細胞中中性脂質的積累。此外，MUT-NSUN2未能改變OS細胞中中性脂質的含量，而依托莫司則增加了OS細胞中中性脂質的含量。與NSUN2過表達相比，環亮氨酸可通過降低FABP5 mRNA的m5C水平來降低FABP5的表達，從而影響OS細胞中中性脂質含量(圖6A-D)。此外，我們還檢測了游離脂肪酸(FFAs)和甘油的含量，以評估OS細胞的脂解活性。結果表明，OE-NSUN2和OE-FABP5均能促進骨肉瘤細胞中FFAs和甘油的水平。正如預期的那樣，MUT-NSUN2未能改變OS細胞中FFAs和甘油的含量，而依托莫司則降低了OS細胞中FFAs和甘油的含量(圖6E-H)。綜上所述，NSUN2通過上調FABP5在OS細胞中的表達，促進中性脂質的脂解。

7）脂肪酸氧化抑制劑和FABP5缺乏均可抵消NSUN2對OS進展的積極作用

為了進一步證實NSUN2是否通過促進FABP5的表達和脂肪酸代謝促進OS的進展，我們對143b細胞進行了功能挽救實驗。我們首先檢測了FABP5 mRNA(圖7A)和蛋白質(圖7B)的表達水平。CCK-8的結果表明(圖7C)和菌落形成實驗(圖7D,G)， NSUN2過表達對143b細胞增殖有促進作用，但這種促進作用可被依托莫司或FABP5缺失所抵消。FABP5過表達對143b細胞增殖的促進作用與NSUN2過表達相似。此外，依莫莫司可降低143b細胞的增殖。在transwell和傷口愈合試驗中也得到了類似的結果。NSUN2過表達對143b細胞的遷移和侵襲有積極影響，但這種積極影響被FABP5缺失或依托莫司抵消。FABP5過表達對143b細胞的遷移和侵襲也有積極影響，而依托莫司則有負面影響(圖7E, F, H, I)。此外，我們利用動物模型進一步驗證了NSUN2-FABP5軸在OS進展中的功能作用。IHC結果(圖7I, J)證明過表達NSUN2可以提高Ki-67的表達，而sh-FABP5可以抵消這種促進作用。綜上所述，證明NSUN2通過促進FABP5的表達和脂肪酸代謝來促進OS的進展，而這種促進作用可以通過FABP5缺失或脂肪酸氧化抑制劑依托莫司來抵消。

結論：

NSUN2通過m5C提高FABP5 mRNA的穩定性，上調FABP5的表達，從而促進骨肉瘤細胞的脂肪酸代謝，最終起到促進骨肉瘤進展的作用。

參考文獻：

Yang M, Wei R, Zhang S, Hu S, Liang X, Yang Z, Zhang C, Zhang Y, Cai L, Xie Y. NSUN2 promotes osteosarcoma progression by enhancing the stability of FABP5 mRNA via m5C methylation. Cell Death Dis. 2023 Feb 15;14(2):125. doi: 10.1038/s41419-023-05646-x.