實驗方法：RT?qPCR，Western blotting，CCK?8，克隆形成實驗，流式，裸鼠異種移植模型，免疫組化，RNA pull?down，RIP?qPCR。

  奧沙利鉑耐藥是一個復雜的過程，是結直腸癌治療過程中最不利的因素之一。lncRNAs是近年來出現的治療耐藥的新型分子，但其介導的具體分子機制尚不清楚。AC092894.1表達在奧沙利鉑誘導的耐藥CRC細胞中顯著下調。體內外實驗表明，AC092894.1具有逆轉藥物耐藥的作用。機制研究表明AC092894.1作為支架分子，通過USP3介導AR的去泛素化，從而增加RASGRP3的轉錄。最后，持續激活MAPK信號通路可誘導CRC細胞凋亡。總之，本研究確定AC092894.1是CRC化療耐藥的抑制因子，并揭示了靶向AC092894.1/USP3/AR/RASGRP3信號軸是治療奧沙利鉑耐藥的一種新選擇。

技術路線

結果

1）AC092894.1在CRC細胞和對奧沙利鉑耐藥的患者組織中的表達降低

  為了研究lncRNAs在結直腸癌奧沙利鉑耐藥中的作用，我們首先通過連續給藥長達6個月的方法構建了奧沙利鉑耐藥CRC細胞LoVo (LoVo- OxR)。通過細胞活力測定比較LoVo-OxR及其親本細胞對奧沙利鉑的敏感性，并計算半最大抑制濃度(IC50)(圖1A)。我們對LoVo和LoVo-OxR的lncRNA進行全基因組測序分析，火山圖顯示差異基因分布(圖1B)，并在測序結果中篩選出兩個下調最顯著的lncRNA。通過RT-qPCR檢測，AC092894.1基因下調最為顯著(圖1C)。AC092894.1在奧沙利鉑耐藥CRC臨床樣本中顯著下調，提示AC092894.1基因可能與患者奧沙利鉑耐藥有關(圖1D)。在40例CRC患者中，AC092894.1高表達的患者被觀察到預后良好(圖1E)。使用我們團隊構建的CRC類器官，AC092894.1的表達被奧沙利鉑顯著下調(圖1F, G)。我們使用6個暴露于不斷增加濃度的奧沙利鉑的CRC細胞系，并注意到HT-29和RKO與其他CRC細胞系相比具有天然抗性，而LoVo表現出最高程度的敏感性(圖1H)。此外，我們采用RT-qPCR檢測AC092894.1的表達隨著耐藥的增加而降低(圖1I)。

圖1

2）CRC細胞中奧沙利鉑敏感性的增加與AC092894.1的異位過表達有關

  構建AC092894.1過表達質粒，分別轉染LoVo-OxR和HCT116-OxR細胞。對其過表達效率的檢測顯示其可穩定表達(圖2A)。細胞活力測定顯示，過表達AC092894.1后，奧沙利鉑對耐藥CRC細胞的作用隨著奧沙利鉑濃度的增加而增強(圖2B, C)。我們在凋亡實驗中發現了一個有趣的現象，AC092894.1過表達僅在奧沙利鉑暴露后才促進耐藥CRC細胞的化學敏感性。相反，在暴露于對照溶劑的耐藥CRC細胞中過表達AC092894.1不會促進耐藥CRC細胞的化學敏感性(圖2D, E)。然后，我們在菌落形成實驗中發現了相同的模式，其中AC092894.1的過表達僅在暴露于奧沙利鉑的耐奧沙利鉑CRC細胞中顯著促進了化學敏感性(圖2F, G)。Western blotting分析顯示，過表達AC092894.1可顯著促進奧沙利鉑治療后凋亡標志物C-PARP的高表達(圖2H)。

圖2

3）CRC細胞對奧沙利鉑的敏感性通過AC092894.1的下游效應分子RASGRP3增加

  為了進一步探索AC092894.1促進CRC細胞耐藥的分子機制，我們用RNA-seq分析了穩定表達的AC092894.1細胞及其對照載體細胞。火山圖顯示了差異表達的基因(圖3A)。KEGG富集分析顯示，AC092894.1過表達后的大部分差異表達基因參與TNF信號通路和MAPK信號通路(圖3B)。我們的結果還顯示，過表達AC092894.1激活了CRC耐藥細胞中的MAPK信號通路(圖3C)。基于這些結果，AC092894.1可能作為MAPK信號通路的一部分參與了奧沙利鉑耐藥的發生。為了研究AC092894.1是如何參與調控MAPK信號通路的，我們在RNA-seq數據庫中篩選了AC092894.1過表達與對照之間MAPK信號通路中差異表達的關鍵基因。此外，這些基因被實時定量PCR驗證。結果顯示，AC092894.1過表達后，RASGRP3在mRNA水平上顯著上調。LoVo-OxR和HCT116-OxR的驗證也顯示了RASGRP3蛋白水平的顯著上調(圖3D, E)。推測RASGRP3可能是AC092894.1的下游效應分子。通過實時熒光定量PCR，我們發現RASGRP3在奧沙利鉑耐藥CRC患者中顯著下調(圖3F)。

圖3

4）AC092894.1通過在轉錄水平調控RASGRP3的表達，介導CRC細胞的化療耐藥

  為了確定RASGRP3對于AC092894.1在CRC細胞中介導奧沙利鉑耐藥是否至關重要，我們分別在LoVo-OxR (AC092894.1)和HCT116-OxR (AC092894.1)細胞中敲除RASGRP3(圖4A)。細胞活力、凋亡和菌落形成的結果表明，敲除RASGRP3可恢復耐藥CRC細胞對奧沙利鉑的耐藥(圖4B-F)。此外，我們發現過表達AC092894.1通過雙熒光素酶報告基因促進了RASGRP3的啟動子活性(圖4G)。這一結果表明，RASGRP3表達的改變是由轉錄水平的改變引起的。

圖4

5）AR作為轉錄因子促進RASGRP3的轉錄并介導化療耐藥

  我們一直在應用PROMO數據庫來預測RASGRP3，因為我們可以研究已經發生的轉錄變化。我們發現GATA-2、RXRα、FOXP3和AR可能是它們潛在的轉錄因子(圖5A)。進一步分析發現AC092894.1過表達后，LoVo-OxR和HCT116-OxR細胞中只有AR上調(圖5B)，提示AR可能是影響RASGRP3轉錄的關鍵因素。為了探索AR是否也介導耐藥，我們分別在LoVo-OxR (AC092894.1)和HCT116-OxR (AC092894.1)細胞中敲除AR(圖5C)。如圖5D-G所示，敲除AR可增強耐藥CRC細胞對奧沙利鉑的耐藥。進一步發現，AR的下調可恢復RASGRP3 mRNA水平和啟動子活性(圖5H, I)。實時定量PCR顯示，在奧沙利鉑耐藥CRC患者中，AR表達顯著降低(圖5J)。

圖5

6）AC092894.1作為支架分子招募USP3促進AR去泛素化

  為了探究AC092894.1與AR的關系，我們假設AC092894.1通過與AR直接結合來調控AR。我們使用生物素化AC092894.1探針及其反義探針進行RNA敲除，然后進行Western blotting分析。原理圖見圖6A。結果顯示AC092894.1可以捕獲AR的特征，但反義探針并沒有富集AR(圖6B)。隨后，我們通過RIP實驗發現，與IgG相比，AR抗體可以特異性捕獲AC092894.1(圖6C)。這些結果證明AC092894.1可以與AR相互作用。為了探索AC092894.1是否可以在mRNA水平上影響AR的表達，我們通過RT-qPCR檢測了LoVo-OxR和HCT116-OxR細胞中AR的表達，發現AC092894.1不能在mRNA水平上調控AR(圖6D)，因此AC092894.1可能通過蛋白水平或其他方式影響AR的表達。LncRNAs常被報道作為引導物、誘餌或支架參與信號轉導。因此，我們大膽推測AC092894.1是否具有支架分子的功能。接下來，我們對RNA下拉蛋白進行了質譜分析。質譜與去泛素酶預測數據庫Ubibrowser的交叉分析表明，USP3可能是一個潛在的關鍵分子(圖6E)。通過RNA下拉實驗，我們發現AC092894.1可以捕獲USP3，但其反義探針不能捕獲USP3 (圖6F)。接下來，我們通過RIP實驗發現AC092894.1在USP3抗體上的富集程度明顯高于IgG抗體。這進一步證明了AC092894.1與USP3的結合(圖6G)。此外，我們發現AC092894.1過表達后，USP3在LoVo-OxR和HCT116-OxR細胞中的表達沒有明顯變化(圖6H)。我們發現過表達AC092894.1促進了USP3與AR的共免疫沉淀相互作用(圖6I)。敲低USP3促進了AR的蛋白降解(圖6J)。進一步的實驗發現，過表達AC092894.1促進了AR的去泛素化(圖6K)。這些結果表明，AC09894.1可以作為將USP3募集到AR的支架分子，促進其去泛素化，從而增加AR的蛋白質水平。

圖6

7）AC092894.1異位過表達增加體內奧沙利鉑敏感性

  為了研究AC092894.1在體內對CRC耐藥的調節作用，我們將HCT116-OxR細胞皮下注射到裸鼠體內。小鼠皮下腫瘤形成后，腹腔注射奧沙利鉑(ip, 5mg /kg / d)。腫瘤大小每5天測量一次，而受試者每3天接受DMSO (0.1 mL/kg)或乙醇(0.1 mL/kg)(圖7A)。過表達AC092894.1增加了CRC細胞對奧沙利鉑的敏感性，導致腫瘤密度降低，體積變小(圖7B-D)。對于小鼠腫瘤，采用RT-qPCR進行驗證(圖7E)。免疫組化實驗顯示AC092894.1過表達后p-p38和RASGRP3的表達增加(圖7F)。總之，這些發現表明AC092894.1可能是克服CRC患者奧沙利鉑耐藥的有效治療靶點。

圖7

結論：我們發現了一個新的lncRNA AC092894.1，它在奧沙利鉑耐藥CRC中顯著下調。機制研究表明AC092894.1可通過招募USP3促進AR的去泛素化。增強AR的穩定性可以進一步促進RASGRP3的轉錄，從而激活MAPK信號通路，最終導致CRC細胞的化療敏感性。我們的研究結果表明AC092894.1對奧沙利鉑的拮抗至關重要，并認識到AC092894.1在CRC中的潛在治療用途及其下游影響。

參考文獻：Zheng Z, Wu M, Li H, Xu W, Yang M, Pan K, Ni Y, Jiang T, Zheng H, Jin X, Zhang Y, Ding L, Fu J. Downregulation of AC092894.1 promotes oxaliplatin resistance in colorectal cancer via the USP3/AR/RASGRP3 axis. BMC Med. 2023 Apr 3;21(1):132. doi: 10.1186/s12916-023-02826-6.