缺血再灌注損傷(IRI)是急性腎損傷(AKI)的主要原因之一，實驗工作揭示了腎臟炎癥反應的詳細情況。T細胞和NFκB通路在IRI中起重要作用。因此，我們在IRI實驗模型中研究了IKK1在CD4+T淋巴細胞中的調節作用和機制。CD4cre和CD4IKK1Δ小鼠誘導IRI。與對照組小鼠相比，CD4+T淋巴細胞中IKK1的條件缺失顯著降低了血清肌酐、血尿素氮（BUN）水平和腎小管損傷評分。在機制上，CD4+T淋巴細胞中IKK1的缺失降低了CD4淋巴細胞向Th1/Th17細胞分化的能力。與IKK1基因消融類似，IKK的藥理抑制也能保護小鼠免受IRI。總之，淋巴細胞IKK1通過促進T細胞分化為Th1/Th17在IRI中發揮關鍵作用，靶向淋巴細胞IKK1可能是IRI的一種新的治療策略。本文于2023年4月發表于“Cellular and Molecular Life Sciences”（IF=9.207）上。

技術路線

結果：
1）IRI后腎臟中NFκB通路的激活
       為了驗證IRI期間腎臟中NFκB通路的激活，我們查詢了在IRI后2h、4h、24h、48h、72h、7d、14d和28d時間點收集的小鼠腎臟大量RNA數據集(GSE98622)以及相應的假手術小鼠腎臟對照RNA，以檢測9種NFκB激活基因的表達水平(NFκB激活評分)。與假手術組相比，IRI誘導后超過2h的所有時間點NFκB激活評分均上調(圖1A, B)。此外，當我們對IRI后腎臟中Nfkb1、Nfkb2和Relb的表達進行RT-PCR分析時，這些基因的表達在IRI誘導后也顯著增加(圖1C)。
       為了捕獲IRI的腎細胞和腎CD4+T細胞景觀，我們在IRI發生2天后整合了全小鼠腎臟在線單核RNA測序數據集(GSE139107)和CD4+T細胞單細胞RNA測序數據集(E-MTAB-8002)(圖2A)。無監督聚類識別出IRI誘導后腎臟中的14個腎細胞簇和1個CD4+T細胞簇，包括上皮細胞和非上皮細胞。我們評估了所有細胞群中的NFκB激活評分，發現與所有細胞群相比，T細胞中的NFκB激活評分顯著上調(圖2B)。接下來，我們更精確地分析了IRI后2天的CD4+T細胞數據集(E-MTAB-8002)，并與對照小鼠的CD4+T細胞整合。通過無監督聚類，我們確定了9個細胞群，包括Th1_1、Th1_2、Th2、Th17、Tnai (na?ve T細胞)、Tcm(中樞記憶T細胞)、Treg(調節性T細胞)、Prolif(增殖T細胞)和ISAG (IFN信號相關基因高表達T細胞)(圖2C)。為了剖析IRI對腎臟中CD4+T細胞組成的影響，我們比較了對照小鼠和IRI小鼠的CD4+T細胞亞群(圖2D)。結果表明，Th17群體在炎癥腎臟中更為豐富，表明該群體可能是IRI早期的重要致病因素。綜上所述，這促使我們假設CD4+T細胞中NFκB的激活有助于IRI的發病機制。

2）CD4+T細胞中的IKK1驅動IRI
       為了研究腎炎癥過程中NFκB激活在CD4+T細胞中的功能作用，我們通過CD4cre與相應的flox小鼠雜交，特異性刪除了激活CD4+T細胞中NFκB通路的關鍵分子IKK1(Chuk)、IKK2(Ikbkb)、NEMO(Ikbkg)和NIK(Map3k14)。與對照小鼠相比，CD4IKK1Δ小鼠的血尿素氮(BUN)水平和肌酐水平(功能性腎損害的代表性標志物)顯著降低，而CD4IKK2Δ、CD4NEMOΔ和CD4NIKΔ小鼠則無顯著差異(圖3A、B)。此外，腎臟切片的形態學評估也顯示CD4IKK1Δ小鼠腎小管損傷顯著降低，而其他組則無顯著差異(圖3C、D)。在CD4IKK1Δ小鼠中，腎臟Nfkb1和Nfkb2基因表達也顯著降低，這表明在CD4IKK1Δ小鼠中，NFκB通路的激活發生了顯著變化(圖3E)。綜上所述，我們的數據表明，CD4+T細胞中的IKK1是IRI中腎組織損傷的主要驅動因素。

3）藥理抑制IKK1可保護小鼠IRI
       關于IKK1在IRI中的致病作用及其對CD4+T細胞分化過程的重要性，我們研究IKK1的藥物阻斷是否可以減輕腎損害。因此，我們在IRI誘導前后用IKK1/IKK2抑制劑KINK-1治療小鼠，阻斷IKK1的激活。(圖4A)。誘導IRI后，與載藥治療相比，IKK1抑制降低了腎損傷的嚴重程度(圖4B，4C)。

4）IKK1促進CD4+T細胞產生細胞因子
       為了研究IKK1對IRI后腎CD4+T細胞細胞因子產生的影響，我們對浸潤腎臟的免疫細胞進行了流式細胞術。基于流式細胞術的CD4cre和CD4IKK1Δ小鼠的白細胞染色顯示，IRI誘導2天后，腎臟浸潤的淋巴細胞中約40%是CD4+T細胞(圖5A)。細胞因子染色結果顯示，IRI誘導后，CD4IKK1Δ小鼠的IFN-γ和IL-17A的產生均增加，此外，與CD4cre小鼠相比，CD4IKK1Δ小鼠中這兩種細胞因子的產生均顯著減少(圖5B, C)。綜上所述，IKK1對Th1細胞和Th17細胞的分化具有主要的致病作用。

5）IKK1驅動CD4+T細胞的Th17和Th1/Th2分化
       為了進一步探索淋巴樣IKK1在IRI中致病作用的機制，我們進行了大量RNA測序，分析了IRI后CD4cre或CD4IKK1Δ小鼠腎CD4+T細胞的RNA轉錄組譜。從基因表達譜和整體表達相似性來看，各組個體重復具有高度同源性(圖6A)。共識別248個DEG，其中下調基因228個，上調基因20個(圖6B)。在下調的基因中，大多數與炎癥相關，并富集KEGG術語“Th1和Th2細胞分化”、“Th17細胞分化”和“炎癥性腸病”(圖6C)，而上調基因大多富集“ECM受體相互作用”、“凋亡”和“軸突引導”(圖6D)。在“Th1/ Th2細胞分化”和“Th17細胞分化”中，Tbx21、Il2ra、Il17a和H2-Ab1的富集也符合對NFκB如何調節T細胞免疫應答的理解(圖6E)。對腎臟Ifng、Tbx21、Cxcr3、Il17、Rorc和Ccr6基因表達的RT-PCR分析也證實了IRI后炎癥腎臟中Th1和Th17的分化依賴于IKK1(圖7)。綜上所述，IKK1通過影響CD4+T細胞的分化在IRI中起著重要的致病作用，抑制CD4+T細胞中的IKK1可減輕IRI損傷。

結論
       IKK1的抑制可以通過影響NFκB通路的激活來抑制CD4+T細胞向Th1和Th17細胞分化的能力，從而降低IRI損傷的程度。
實驗方法
       PAS染色，流式，qPCR，RNA測序，單細胞測序。
參考文獻
Song N, Xu Y, Paust HJ, Panzer U, de Las Noriega MM, Guo L, Renné T, Huang J, Meng X, Zhao M, Thaiss F. IKK1 aggravates ischemia-reperfusion kidney injury by promoting the differentiation of effector T cells. Cell Mol Life Sci. 2023 Apr 19;80(5):125. doi: 10.1007/s00018-023-04763-2.