腹膜轉移(PM)是胃癌（GC）的重要轉移方式。它與預后不良有關。PM的潛在分子機制仍然難以捉摸。m5C是一種轉錄后RNA修飾，參與許多腫瘤的進展。然而，其在GC腹膜轉移中的作用尚不清楚。在我們的研究中，轉錄組結果表明NSUN2在PM中的表達顯著上調。PM NSUN2高表達的患者預后較差。機制上，NSUN2通過m5C修飾調控ORAI2 mRNA的穩定性，從而促進ORAI2的表達，進而促進胃癌的腹膜轉移和定植。YBX1通過與ORAI2 m5C修飾位點結合，起到“閱讀器”的作用。GC細胞攝取網膜脂肪細胞中的脂肪酸后，轉錄因子E2F1上調，進而通過順式元件促進NSUN2的表達。總之，這些結果揭示了腹膜脂肪細胞為GC細胞提供脂肪酸，從而通過AMPK通路促進E2F1和NSUN2的升高，上調的NSUN2通過m5C修飾激活關鍵基因ORAI2，從而促進GC的腹膜轉移和定植。本文于2023年5月發表于Oncogene（IF= 8.756）上。
技術路線

結果：
1）NSUN2在GC腹膜轉移中高表達，并與GC腹膜轉移相關
       為了探索胃癌腹膜轉移的潛在分子機制，我們通過高通量測序分析，在10對腹膜轉移組織和相應的原發腫瘤組織中測量mRNA表達水平(圖1A)。取TCGA中胃腺癌數據和腹膜轉移轉錄組測序數據的交集，得到2078個差異表達基因。然后根據這些差異表達基因進行Reactome富集分析。有趣的是，這些高表達基因在RNA代謝途徑中顯著富集(圖1B)，這表明胃癌腹膜轉移的RNA表達譜與原發腫瘤有明顯不同。然后通過qPCR驗證腹膜轉移轉錄組測序數據中RNA代謝途徑中差異表達最顯著的基因NOL6、NUP107、NUP160、TRMT6、NAT10和NSUN2的表達情況(圖1C)。NSUN2在20對胃癌組織及相應腹膜轉移組織中的mRNA表達差異最為顯著(圖1D)。10對胃癌腹膜轉移組織及匹配的胃癌組織的免疫組化染色也表明NSUN2在胃癌腹膜轉移中高表達(圖1E)。生存分析表明，腹膜轉移中NSUN2高表達的患者預后較差(圖1F)。這些結果顯示NSUN2在胃癌腹膜轉移中高表達并與不良預后相關，提示NSUN2可能在胃癌腹膜轉移中起重要作用。

2）NSUN2在體外促進GC惡性生物學行為
       為了確定NSUN2與胃癌腹膜轉移的關系，我們選擇了具有高轉移能力的胃癌細胞株HGC-27和MKN-45進行進一步的實驗。集落形成、CCK8實驗顯示，sh-NSUN2顯著降低GC細胞的增殖能力。此外，oe-NSUN2增加了GC細胞的能力(圖2A, B)。接下來，傷口愈合實驗和Transwell實驗表明，敲低NSUN2分別抑制了GC細胞的遷移和侵襲。相反，過表達NSUN2可促進GC細胞遷移和侵襲(圖2C-E)。下調NSUN2抑制GC細胞粘附腹膜間充質細胞系HMrSV5的能力，當NSUN2過表達時，GC細胞粘附腹膜間充質細胞的數量增加(圖2F)。綜上所述，這些結果表明NSUN2在體外胃癌細胞的腹膜轉移和增殖中發揮了重要作用。

3）轉錄因子E2F1在GC細胞中促進NSUN2的表達
       我們尋找可能導致NSUN2在胃癌腹膜轉移中過表達的關鍵上游調控分子。通過篩選JASPAR數據庫，promo數據庫和腹膜轉移轉錄組測序數據，我們發現轉錄因子TFAP2B和E2F1可能參與調節NSUN2表達(圖3A)。此外，TCGA還顯示，NSUN2與E2F1和TFAP2B呈正相關 (圖3B)。然后我們通過qPCR、western blot驗證轉錄因子E2F1可以調控NSUN2的表達，而轉錄因子TFAP2B不能影響NSUN2的表達(圖3D、E)。從圖3F可以看出，NSUN2和E2F1主要定位于細胞核，在HGC-27和MKN-45細胞系中，沉默轉錄因子E2F1后，NSUN2的表達水平降低。這些結果驗證了E2F1能夠調控NSUN2的表達。通過篩選JASPAR數據庫，我們發現轉錄因子E2F1在NSUN2啟動子序列中有3個結合位點。為了進一步研究轉錄因子E2F1是否可以直接結合NSUN2的啟動子序列，我們對JASPAR評分最高的序列(?623~?613)進行了CHIP-qPCR驗證。CHIP-qPCR結果驗證了我們的假設，即轉錄因子E2F1可以通過結合預測的順式元件直接激活NSUN2的表達(圖3G)。熒光素酶測定表明，與野生型NSUN2啟動子序列相比，NSUN2啟動子序列突變體顯著抑制了轉錄活性(圖3H-I)。綜上所述，這些結果證明E2F1可以作為轉錄因子促進NSUN2的表達。

4）腹膜高脂環境通過AMPK途徑激活轉錄因子E2F1
       為了研究腹膜脂肪細胞是否通過激活胃癌細胞AMPK通路調控轉錄因子E2F1，我們從胃癌根治手術患者的網膜組織中提取脂肪細胞。與網膜脂肪細胞共培養48小時后，我們發現胃癌細胞系HGC-27和MKN-45的脂質沉積和β-氧化率增加(圖4A, B)，伴隨著轉錄因子E2F1及其靶基因NSUN2升高(圖4C-E)。在共培養體系中加入AMPK通路抑制劑Dorsomorphin，與脂肪細胞共培養后，轉錄因子E2F1和靶基因NSUN2的過表達得到部分減弱(圖4F)。總之，我們發現網膜脂肪細胞為腹膜轉移性胃癌細胞提供脂肪酸，通過激活AMPK通路，進一步促進轉錄因子E2F1的表達，從而上調NSUN2的表達。

5）NSUN2介導的ORAI2的m5C修飾維持了其穩定性
       為了進一步確定NSUN2是否通過m5C促進GC的惡性生物學行為，將MeRIP-seq、RNA測序(RNA-seq)和HGC-27細胞中NSUN2介導的RNA免疫沉淀測序(RIP-seq)進行交叉分析(圖5A、B)，選擇RNA-seq中差異表達最顯著的4個靶基因(RRBP1、ORAI2、PCNT、CSPG4)進行進一步研究。在這些候選基因中，當NSUN2被敲低時，ORAI2 mRNA表達下調最為顯著，CSGP4表達略有下降，而PNCT、RRBP1 mRNA水平不受影響(圖5C)。此外，在HGC-27和MKN-45細胞中，ORAI2蛋白水平受到NSUN2的持續調節(圖5D、E)。為了進一步研究NSUN2是否通過m5C依賴的方式促進ORAI2的表達。通過MeRIP-qPCR進一步驗證NSUN2介導的ORAI2 m5C修飾位點，結果顯示，與IgG對照抗體相比，m5C特異性抗體在NSUN2敲除GC細胞上的ORAI2 mRNA富集被顯著抑制(圖5F)。接下來，為了進一步探究NSUN2是否通過m5C修飾調控ORAI2，構建NSUN2催化位點(半胱氨酸321)突變質粒。與對照細胞相比，在過表達NSUN2的GC細胞中，ORAI2的表達水平顯著升高，而催化位點突變體NSUN2的細胞中表達水平則沒有升高(圖5G, H)。考慮到m5C修飾正向調節ORAI2的mRNA水平，我們進一步研究了m5C修飾是否影響ORAI2的穩定性。結果表明，ORAI2 mRNA水平在NSUN2過表達時高度穩定，而在NSUN2敲除時則相反(圖5I)。這些結果證實了NSUN2可以通過m5C修飾穩定ORAI2 mRNA來調節ORAI2的表達。

6）YBX1識別ORAI2的m5C修飾并調控其mRNA穩定性
       最近有研究報道，YBX1屬于m5C閱讀器家族，可以通過識別mRNAs的m5C修飾來調控靶基因的穩定性。為了驗證YBX1是否可以通過m5C修飾來調節ORAI2的穩定性，當YBX1被敲低時，ORAI2的表達水平下降，同時ORAI2的穩定性下降(圖6A-C)。然后使用生物素標記的ORAI2或m5C-ORAI2 RNA探針進行RNA下拉，然后進行western blot驗證YBX1可以識別ORAI2的m5C修飾(圖6D)。EMSA實驗得出了一致的結果(圖6E)。RIP-qPCR也證明了YBX1與ORAI2 m5C位點之間的直接相互作用(圖6F)。此外，YBX1過表達可以部分挽救NSUN2敲低對ORAI2表達的影響(圖6G)。研究表明，腫瘤的腹膜轉移主要是由PI3K/AKT通路的異常激活引起的。然后，在GC細胞中沉默ORAI2時，PI3K-AKT通路被抑制(圖6H)。這些數據表明，NSUN2介導的m5C修飾通過YBX1依賴的ORAI2 mRNA穩定性來維持ORAI2的表達。

7）NSUN2通過上調ORAI2的表達促進GC惡性過程
       為了進一步探討NSUN2是否通過ORAI2促進胃癌腹膜轉移，我們將過表達的ORAI2質粒轉染到NSUN2敲低的細胞株HGC-27和MKN-45中。我們發現，過表達ORAI2可恢復NSUN2敲除細胞系HGC27和MKN45的增殖能力(圖7A, B)。此外，ORAI2表達升高可恢復NSUN2敲除細胞系HGC27和MKN45的遷移、侵襲和粘附腹膜間皮細胞能力(圖7C-F)。因此，我們發現NSUN2通過上調ORAI2的表達來加速GC惡性生物學行為。

8）NSUN2在體內通過上調ORAI2表達促進腹膜轉移
       為了進一步探討NSUN2-ORAI2軸在體內對胃癌腹膜轉移的影響，我們將穩定轉染了靶向NSUN2 的shRNA或其陰性對照組的HGC27熒光細胞腹腔注射到BALB/c裸鼠體內。通過體內熒光成像，我們發現NSUN2敲低組的腹膜轉移程度明顯低于對照組(圖8A)。NSUN2過表達組BALB/c裸鼠腹膜轉移程度更高(圖8B)。腹膜轉移生態位切片的HE染色也顯示，胃癌細胞中NSUN2下調后，轉移結節數量顯著減少(圖8C)。這些結果表明，NSUN2在體內促進了胃癌腹膜轉移。我們還發現，ORAI2在NSUN2敲低組的腹膜轉移組織中表達下調，通過免疫組化和western blot發現，NSUN2和ORAI2的表達呈正相關(圖8C, D)。為了進一步探討NSUN2介導的ORAI2在胃癌腹膜轉移中的作用，我們將四組胃癌細胞腹腔注射到BALB/c裸鼠體內。我們發現，在穩定敲低的NSUN2細胞系中轉染ORAI2過表達質粒后，NSUN2促進腹膜轉移的能力顯著增強(圖8E)。這些結果證明ORAI2是體內NSUN2介導的腹膜轉移的效應者。

結論
       我們的研究證明了高脂肪微環境通過調節NSUN2-m5C-ORAI2-PI3K-AKT信號軸在胃癌腹膜轉移和定植中的重要作用。這些發現提示了微環境改變后腹膜轉移性胃癌細胞通過RNA表觀遺傳修飾發生適應性改變，為胃癌腹膜轉移提供了治療靶點。
實驗方法
       轉錄組測序，菌落形成，CCK-8，傷口愈合實驗，transwell，WB，qRT-PCR，脂質染色，RIP，ChIP，MeRIP，EMSA，動物實驗。
參考文獻：Liu K, Xu P, Lv J, Ge H, Yan Z, Huang S, Li B, Xu H, Yang L, Xu Z, Zhang D. Peritoneal high-fat environment promotes peritoneal metastasis of gastric cancer cells through activation of NSUN2-mediated ORAI2 m5C modification. Oncogene. 2023 Jun;42(24):1980-1993. doi: 10.1038/s41388-023-02707-5.