動脈粥樣硬化是一種進行性炎癥性疾病，其特征是大動脈或大動脈內(nèi)的脂質(zhì)積聚和細胞死亡，可導致心臟、大腦和四肢缺血。巨噬細胞死亡是動脈粥樣硬化病變的決定因素。焦亡是一種炎癥性細胞死亡，能夠促進晚期動脈粥樣硬化病變，然而，具體的分子機制尚不完全清楚。在此，作者通過單細胞RNA測序（scRNA-seq）分析發(fā)現(xiàn)GSDME主要在巨噬細胞中表達，揭示GSDME在動脈粥樣硬化發(fā)展過程中的轉(zhuǎn)錄機制，同時也發(fā)現(xiàn)GSDME介導的細胞焦亡促進動脈粥樣硬化，因此，GSDME介導的動脈粥樣硬化進展中的焦亡可能是動脈粥樣硬化的潛在治療方法。該研究于2023年2月發(fā)表在《Nature Communications》IF:16.6。

技術(shù)路線

主要研究結(jié)果
1、焦亡與人和小鼠動脈粥樣硬化有關(guān)
       為研究動脈粥樣硬化的超微結(jié)構(gòu)，作者從接受頸動脈內(nèi)膜切除術(shù)的患者身上獲得動脈粥樣硬化斑塊組織，通過透射電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)大量巨噬細胞由于高吞噬負荷而死亡或破碎（圖1a）。病變組織垂死的巨噬細胞中的溶酶體內(nèi)充滿未完全降解的細胞殘留物，質(zhì)膜上形成孔（圖1b）。以上結(jié)果說明大部分巨噬細胞死于細胞焦亡而非細胞凋亡。免疫組化結(jié)果顯示，與對照血管相比，動脈粥樣硬化組織IL-1β、caspase3和GSDME表達水平升高（圖1c）。隨后，作者使用原位鄰近連接技術(shù)觀察動脈粥樣硬化斑塊中GSDME和Caspase3之間的相互作用，并評估GSDME激活和Caspase3介導的焦亡，發(fā)現(xiàn)總體蛋白相互作用和免疫組織化學IL-1β染色信號的分布模式相似（圖1d），說明焦亡可能與炎癥相關(guān)。此外，作者還觀察到在高脂飲食喂養(yǎng)的ApoE^?/?小鼠中， TUNEL陽性細胞核通常位于主動脈根部的動脈粥樣硬化病變處。以上結(jié)果共同說明GSDME介導的焦亡參與動脈粥樣硬化炎癥。

圖1 人和小鼠動脈粥樣硬化斑塊中發(fā)生焦亡

2、GSDME主要在動脈粥樣硬化巨噬細胞中表達
       為研究人動脈粥樣硬化斑塊的轉(zhuǎn)錄組以及GSDME在動脈粥樣硬化中的定位，作者對鈣化或出血的晚期人頸動脈粥樣硬化斑塊的細胞進行scRNA-seq，發(fā)現(xiàn)GSDME主要在M1巨噬細胞中表達（圖2a和2b）。GSDME和巨噬細胞標志物CD68的共染色的結(jié)果說明GSDME定位在CD68標記的巨噬細胞，與測序結(jié)果一致（圖2d）。作者對巨噬細胞的發(fā)育時間進行分析發(fā)現(xiàn)巨噬細胞處于細胞發(fā)育的后期（圖2c），說明GSDME主要在巨噬細胞的后期發(fā)揮作用。

圖2 GSDME主要在動脈粥樣硬化巨噬細胞中表達

3、GSDME在人和小鼠動脈粥樣硬化斑塊中的表達增加
       為探索GSDME表達是否在人動脈粥樣硬化斑塊中發(fā)生改變，作者對GSE43292數(shù)據(jù)庫中32個病人動脈粥樣硬化斑塊和鄰近正常組織的基因表達進行分析，發(fā)現(xiàn)GSDME在人動脈粥樣硬化斑塊中的表達顯著增加（圖3a）。Western blot結(jié)果表明，與正常血管和早期動脈粥樣硬化斑塊相比，晚期動脈粥樣硬化斑塊中完整的GSDME和活化的GSDME（N-GSDME）蛋白水平顯著增加（圖3b）。此外，作者在動脈粥樣易硬化易發(fā)的ApoE^?/?小鼠中，發(fā)現(xiàn)在喂食高脂飲食12周后，GSDME的蛋白和mRNA水平顯著升高（圖3c和3d）。與 GSDME mRNA 水平升高一致，ApoE^?/?小鼠主動脈促炎基因IL-1β、TNF、MCP-1 和 IL-6 的 mRNA 水平也顯著升高，說明GSDME在調(diào)節(jié)動脈粥樣硬化斑塊形成方面至關(guān)重要。

圖3 動脈粥樣硬化時GSDME表達增加

4、GSDME缺失可減輕ApoE^?/?小鼠飲食誘導的動脈粥樣硬化
       結(jié)合之前的結(jié)論GSDME在動脈粥樣硬化中的表達增加，作者想知道缺失GSDME是否會抑制動脈粥樣硬化的發(fā)展。因此，作者設(shè)置ApoE^?/?對照小鼠和GSDME ^?/?/ApoE^?/?小鼠高脂飲食喂養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)兩組小鼠血清中總膽固醇、HDL（高密度膽固醇）和LDL（低密度膽固醇）水平?jīng)]有明顯差異（圖3a-3c）。但是油紅O染色和HE染色實驗結(jié)果表明，與對照組相比，GSDME ^?/?小鼠動脈粥樣硬化病變面積減少28%（圖4d），主動脈竇和頭臂動脈病變大小和面積也顯著減少（圖4e和4f）。除此之外，作者還發(fā)現(xiàn)與對照組相比，GSDME ^?/?小鼠主動脈促炎因子TNF，IL-1β，IL-6和MCP-1的mRNA水平顯著降低。綜上所述，說明GSDME缺失減輕ApoE^?/?小鼠飲食誘導的動脈粥樣硬化和炎癥。

圖4 GSDME缺失減弱動脈粥樣硬化病變面積和大小

5、ox-LDL誘導巨噬細胞中的GSDME表達和焦亡
       為進一步評估動脈粥樣硬化刺激對體外GSDME表達的影響，作者將原代腹膜巨噬細胞（PMs）和骨髓來源巨噬細胞（BMDMs）與ox-LDL孵育，在體外模擬動脈粥樣硬化的條件。發(fā)現(xiàn)經(jīng)ox-LDL處理后，PMs和BMDMs細胞中GSDME蛋白表達水平和mRNA顯著升高（圖5a-5d）。有研究表明GSDME在被Caspase3切割后在質(zhì)膜上形成孔，進而驅(qū)動細胞從凋亡到焦亡的轉(zhuǎn)變。IP實驗表明GSDME和Caspase3之間存在明顯結(jié)合（圖5e），說明GSDME的確能夠被Caspase3所切割。為評估ox-LDL誘導的巨噬細胞焦亡的程度，作者測量釋放到培養(yǎng)基中的乳酸脫氫酶（LDH）的活性來表征焦亡程度。發(fā)現(xiàn)ox-LDL以劑量依賴性方式促進細胞死亡，GSDME缺失減弱LDH的釋放，說明GSDME是ox-LDL誘導的焦亡所必需的。綜上所述，ox-LDL可以上調(diào)GSDME的表達，誘導巨噬細胞焦亡，進而促進動脈粥樣硬化的進展。

圖5 ox-LDL誘導巨噬細胞GSDME表達

6、GSDME缺失抑制巨噬細胞遷移和炎癥反應(yīng)
       基于上述的實驗結(jié)果，GSDME缺失抑制動脈粥樣硬化的發(fā)展，GSDME結(jié)合Caspase 3誘導ox- LDL處理的巨噬細胞焦亡，作者進一步提出假設(shè)，GSDME缺失是否能夠減輕巨噬細胞的炎癥行為。作者用ox-LDL處理WT或GSDME ^{- / -}小鼠的腹腔巨噬細胞，結(jié)果顯示，與對照組相比，GSDME ^{- / -}小鼠的細胞粘附相關(guān)基因Lama2、Pcdhb和Itga7表達顯著下降（圖6a和6b），GO分析也證實這一結(jié)論（圖6c）。前人的研究表明通過特定的粘附點粘附到底物上在細胞遷移過程中是必不可少的。Transwell和劃痕實驗結(jié)果表明GSDME缺失顯著減少巨噬細胞的遷移能力（圖6d和6e）。由于動脈粥樣硬化相關(guān)炎癥是由促炎細胞因子、炎癥信號通路和粘附分子所介導的，作者檢測WT和GSDME ^{- / -}小鼠PMs細胞經(jīng)ox-LDL處理后的炎癥反應(yīng)，結(jié)果顯示ox-LDL處理后，GSDME ^{- / -}組PMs細胞的TNF, IL-1β 和 MCP-1的mRNA表達水平顯著降低（圖6f）。WB結(jié)果顯示GSDME ^{- / -}組PMs細胞釋放成熟IL-1β的水平降低（圖6g），說明GSDME是IL-1β釋放的通道。除此之外，作者使用TNF 和環(huán)己亞胺誘導的細胞死亡，測量不同時期PMs培養(yǎng)基中的LDH活性，發(fā)現(xiàn)GSDME ^{- / -}組死亡率顯著降低（圖6h），說明GSDME決定細胞從凋亡到焦亡的轉(zhuǎn)變。綜上所述，GSDME缺失抑制巨噬細胞炎癥反應(yīng)和焦亡。

圖6 巨噬細胞GSDME缺失抑制巨噬細胞炎癥和焦亡

7、STAT3上調(diào)GSDME表達
       前人研究表明STAT3在動脈粥樣硬化過程中是必須的，并且STAT3激活參與動脈粥樣硬化的炎癥反應(yīng)，因此，靶向抑制STAT3可能是一種潛在治療策略。前期結(jié)果表明高脂飲食喂養(yǎng)的ApoE^?/?小鼠主動脈中p-STAT和GSDME蛋白表達水平都顯著升高（圖3c），說明二者之間可能存在某種聯(lián)系。隨后作者發(fā)現(xiàn)與GSDME一樣，STAT3也能在人動脈粥樣硬化巨噬細胞中表達（圖7a），在ox-LDL或Caspase3激活劑TNF處理的PMs細胞中，GSDME和p-STAT3蛋白水平同時升高（圖7b和7c），說明STAT3可能參與GSDME的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。為驗證這一猜想，作者設(shè)計敲低和過表達STAT3實驗，發(fā)現(xiàn)STAT3和GSDME的表達直接相關(guān)（圖7d-7g）。對GSDME基因啟動子序列進行分析，發(fā)現(xiàn)存在4個STAT3的結(jié)合位點（圖7h）。染色質(zhì)免疫沉淀結(jié)果證實STAT3與包含一致序列TTCTGAGAAG的4個結(jié)合位點的結(jié)合增加（圖7i）。此外，STAT3還增加GSDME啟動子驅(qū)動的熒光素酶活性（圖7j）。綜上所述，STAT3 在 GSDME 轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程中發(fā)揮重要功能。

圖7 STAT3靶向GSDME啟動子并激活GSDME轉(zhuǎn)錄

結(jié)論
       GSDME表達在動脈粥樣硬化過程中上調(diào)，GSDME缺失減少動脈粥樣硬化斑塊中焦亡相關(guān)的促炎細胞因子釋放。ox-LDL或TNF通過磷酸化激活STAT3，活化的STAT3促進GSDME轉(zhuǎn)錄。隨后上調(diào)的GSDME增強Caspase3活性并促進細胞凋亡轉(zhuǎn)化為焦亡（圖8）。

圖8 GSDME促進動脈粥樣硬化炎癥反應(yīng)的機制

實驗方法
鄰近連接實驗、免疫組化、免疫熒光染色、RT-PCR、Western blot、Co-IP、ChIP、TUNEL細胞凋亡測定、乳酸脫氫酶（LDH）活性測定、Transwell、劃痕實驗、油紅O染色、HE染色。
參考文獻
Wei Y, Lan B, Zheng T, Yang L, Zhang X, Cheng L, Tuerhongjiang G, Yuan Z, Wu Y. GSDME-mediated pyroptosis promotes the progression and associated inflammation of atherosclerosis. Nat Commun. 2023 Feb 18;14(1):929.