高度保守的依賴NAD⁺的sirtuin脫乙酰酶和單-ADP核糖基轉移酶家族(sirtuins 1-7)是關鍵的表觀遺傳調節因子，在各種模式生物中控制與年齡相關的細胞信號通路并延長壽命。自從發現小鼠體內Sirt6的整體缺失導致孕激素表型、代謝障礙和出生4周內死亡以來，闡明核局部sirtuin 6（SIRT6）在衰老和疾病中的確切作用的努力已經成為當務之急。相反，在雄性和雌性小鼠中，Sirt6的轉基因過表達控制衰老過程中的代謝信號事件，從而延長壽命。一些證據表明，Sirt6調節一系列與年齡相關的生物過程，包括DNA修復、細胞代謝、氧化應激、炎癥、自噬和衰老。
       年齡和關節損傷是骨關節炎（OA）的關鍵風險因素，骨關節炎是最常見的關節疾病，也是老年人殘疾的主要原因。在軟骨細胞中，年齡相關或損傷相關的改變有利于分解代謝而不利于合成代謝的信號事件，這促進了細胞外基質（ECM）成分的丟失，并被認為是OA發展和進展中驅動軟骨降解的原因。最近的證據表明，SIRT6可能是這些過程的關鍵調節因子。例如，體外細胞培養研究表明，SIRT6過表達降低了人軟骨細胞的復制衰老、基質金屬蛋白酶-13水平和核因子-kappaB（nf-?B）調控的基因表達，而SIRT6缺失則增加了軟骨細胞中DNA損傷和端粒功能障礙誘導的病灶的標志物，并顯著抑制了軟骨肉瘤SW1353細胞系中COL2A1和ACAN基因的表達。在小鼠體內的數據表明，Sirt6單倍體功能不全會增加軟骨蛋白多糖丟失和膝下脂肪墊細胞因子水平，導致高脂飲食的中年小鼠的國際骨性關節炎研究學會（OARSI）得分更高。此外，在膠原誘導和K/BxN血清轉移的類風濕性關節炎模型中，小鼠骨髓特異性Sirt6缺陷已被證明可增加關節炎癥和對前分解代謝FOXO1信號事件的敏感性，從而增強關節炎癥。相反，在接受內側半月板去穩定(DMM)手術的年輕小鼠中，關節內給予腺相關病毒或慢病毒SIRT6，以增加關節間隙內的SIRT6水平，提供對軟骨損傷的保護。
       我們以前在原代人軟骨細胞中的研究表明，SIRT6的激活通過增加抗氧化蛋白水平、降低促氧化劑TXNIP水平和快速解毒核產生的H₂O₂來促進對氧化應激的抗性。此外，激活SIRT6顯著減少氧化應激誘導的分解代謝NF-?B信號事件，這些事件與軟骨細胞死亡和骨關節炎有關。重要的是，我們的報告還顯示，在人類關節軟骨細胞中，軟骨細胞SIRT6活性隨著年齡的增長而顯著下降。然而，關節內SIRT6缺乏的影響，以及這如何導致體內軟骨損傷和骨關節炎，在很大程度上仍未被研究。由于先前研究Sirt6體內作用的研究使用了少量實驗小鼠（n = 4–6），本研究的目的是全面確定Sirt6缺乏對OA的影響。由于損傷和年齡是OA的兩個主要危險因素，我們研究了Sirt6缺乏對年輕小鼠的影響，以內側半月板手術作為創傷后OA的模型，并評估了中年（12個月齡）和老年（18個月齡）小鼠自發、自然發生的OA的嚴重程度。SIRT6調節軟骨細胞功能以保護軟骨免受OA侵襲的具體機制在這些小鼠中以及在體外使用原代人軟骨細胞進行了檢測。本文于2023年8月發表于《TRANSLATIONAL SCIENCE》IF=27.4期刊上。
技術路線

主要結果

1.軟骨特異性Sirt6缺乏增加DMM誘導的小鼠骨關節炎的嚴重程度

       因為小鼠Sirt6的整體缺失導致4周齡內死亡，我們建立了可誘導的軟骨特異性Sirt6缺陷小鼠（Sirt6^fl/fl；Aggrecan-Cre^ERT2，（Sirt6 cKO）），并將它們與Sirt6完整的同窩對照組（Sirt6^fl/fl）進行比較。Sirt6完整和Sirt6缺陷小鼠在16周齡時接受DMM手術或假手術，并在術后6周和10周通過組織學、詳細的組織形態計量學和顯微CT分析OA的嚴重程度。在組織學上，接受DMM手術的Sirt6完整和Sirt6缺陷小鼠都出現了OA的癥狀，其特征是在研究的兩個時間點與假對照組相比，關節軟骨結構（ACS）、Toloniumchloride、骨贅和滑膜增生評分顯著增加（圖1A-D）。當比較DMM組（Sirt6完整與Sirt6 cKO）時，與術后6周和10周Sirt6完整小鼠相比，Sirt6缺陷小鼠的ACS、Toloniumchloride和骨贅評分明顯更高（更差）（圖1A-D）。
       與我們的組織學數據一致的是，對脛骨平臺內側和外側的詳細組織形態學分析表明，接受假手術的小鼠幾乎沒有顯示出OA的跡象，而DMM手術在所研究的兩個時間點都產生了OA表型，這由顯著的軟骨損失以及在某些情況下鈣化軟骨的損失和軟骨下骨板（SCBP）面積和厚度的增加所證明（表1和2）。手術后6周，與接受DMM手術的Sirt6完整小鼠相比，接受DMM手術的Sirt6缺陷小鼠的關節軟骨面積和厚度顯著減少（表1）。在第10周時，這種OA表型惡化，并且與經歷DMM的Sirt6完整小鼠相比，軟骨特異性Sirt6缺乏的小鼠也表現出鈣化軟骨厚度的顯著減少和SCBP面積和厚度的增加（表2）。
       微型CT分析脛骨軟骨下骨體積分數（Bv/Tv）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁間距（Tb.Sp）和軟骨下骨板厚度（SCBP）。在所有小鼠的脛骨內側平臺上進行Th。在手術后6周，接受DMM手術的Sirt6基因缺陷小鼠的BV/Tv和Tb.Th顯著增加，Tb.Sp值顯著降低，這表明與接受假手術的SIRT6基因缺陷小鼠相比，這組小鼠的骨硬化程度增強（圖1E和G）。在這一時間點，來自兩個手術組的Sirt6完整小鼠之間沒有觀察到任何變化。術后10周，與假手術組相比，兩個DMM組的BV/Tv和Tb.Th均增加，Tb.Sp顯著降低，表明DMM在這個時間點誘導了骨硬化（圖1F和H）。在分析DMM組之間的差異時，Sirt6缺陷小鼠與Sirt6完整小鼠相比，BV/Tv和Tb.Th顯著增加，Tb.Sp減少，這表明在沒有Sirt6的情況下骨硬化增強（圖1F和H）。接受DMM手術的Sirt6缺陷小鼠的骨贅面積和骨贅體積也顯著大于Sirt6完整小鼠（圖1I，J），這與我們的組織學骨贅評分一致。總之，這些數據表明，小鼠軟骨中Sirt6缺乏增加了DMM誘導的骨性關節炎的嚴重程度。

圖1 Sirt6缺乏對DMM術后骨性關節炎嚴重程度的影響

表1 DMM術后6周Sirt6完整和Sirt6缺陷（Sirt6 CKO）小鼠接受DMM或Sham手術的組織形態計量學分析

表2 DMM術后10周Sirt6完整和Sirt6缺陷（Sirt6 CKO）小鼠接受DMM或Sham手術的組織形態計量學分析

2.軟骨特異性Sirt6缺乏加速小鼠自發的年齡相關性骨性關節炎嚴重程度

       為了評估Sirt6缺乏對自發、自然發生的骨性關節炎的影響，對12個月和18個月齡的Sirt6完整和Sirt6缺乏的小鼠進行了骨性關節炎的嚴重程度分析，根據DMM研究。在12個月大時，與Sirt6完整對照組相比，Sirt6缺陷小鼠的ACS、Toloniumchloride和骨贅總分顯著增加（圖2A，B）。一致的是，詳細的組織形態計量學分析顯示，與Sirt6完整的對照組相比，Sirt6缺陷小鼠的內側和外側關節軟骨面積和鈣化軟骨面積都顯著減少（表3和4）。在小鼠18個月時，兩種基因型都表現出嚴重的骨性關節炎，在脛骨平臺內側有明顯的軟骨丟失，但兩種基因型之間沒有顯著差異（圖2，表3）。在外側，18個月齡的Sirt6缺陷小鼠的關節軟骨面積和厚度與Sirt6正常對照相比顯著減少（表4）。在這項老齡研究中，年齡或基因對滑膜增生沒有影響（圖2B）。同樣，當我們在兩個時間點分析來自兩個基因型的四肢時，我們沒有通過Micro-CT檢測到軟骨下骨參數（內側）的任何顯著差異（圖2E，F）。滑膜增生和軟骨下骨改變不受年齡的影響，這一發現與我們之前在類似時間點評估這些參數的小鼠研究一致。對18月齡Sirt6完整小鼠和Sirt6基因缺陷小鼠的關節組織切片進行免疫組織化學檢測，以檢測作為衰老標志的p16^ink4a。與正常對照組相比，Sirt6基因缺陷小鼠滑膜中p16^ink4a陽性細胞顯著增加（p=0.0031）。綜上所述，這些數據表明，軟骨特異性Sirt6缺乏顯著加速了小鼠自發的、與年齡相關的骨性關節炎。
       有趣的是，當分析6個月大的DMM組（假手術后10周）的對照小鼠肢體，并將它們與12個月和18個月大的完整Sirt6對照進行比較時，我們觀察到BV/Tv和Tb.Th值增加，而Tb.Sp值在老年小鼠肢體中降低。這一發現表明，小鼠的衰老本身就會增加軟骨下骨硬化癥，據我們所知，這是一個原創性的發現。

圖2 SIRT6缺乏對衰老過程中骨性關節炎嚴重程度的影響

表3 12月齡和18月齡Sirt6完整和Sirt6缺陷（Sirt6 CKO）小鼠（脛骨內側平臺）的組織形態計量學分析

表4 Sirt6完整和Sirt6缺陷（Sirt6 CKO）小鼠12月齡和18月齡（脛骨外側平臺）的組織形態計量學分析

3.Sirt6缺陷與人軟骨細胞ECM和生長因子基因下調有關

       為了確定Sirt6介導的轉錄調控的作用，對缺失Sirt6的原代人軟骨細胞進行了RNA測序，并與干擾的小干擾RNA（SiRNA）對照細胞（72小時）進行了比較。初步研究證實SIRT6 siRNA缺失，并證明與對照組相比，SIRT6 siRNA的核導入導致SIRT6蛋白水平顯著降低（p=<0.0001）。在我們的RNA測序數據集中，主成分分析表明，按治療方法分組。SIRT6缺失的樣本與對照組的比較顯示，236個基因差異表達，其中160個基因下調，76個基因上調（圖3A）。分析表明，軟骨細胞SIRT6的缺失預計會增加關節炎癥、軟骨損傷和OA疾病的進程。基因本體論濃縮分析表明，與對照組相比，細胞外基質、蛋白質類細胞外基質（細胞成分）和生長因子活性（分子功能）術語是缺失SIRT6的人軟骨細胞中最受抑制的三個過程（圖3B）。
       對差異表達的ECM基因的查詢顯示，在關節軟骨中發現的主要膠原COL2A1在SIRT6缺失的細胞中與其他ECM基因如COMP、ECM2、CILP2和COL8A1一起顯著減少。qRT-PCR法顯示，與對照組相比，SIRT6缺陷軟骨細胞中COL2A1（p=0.0008）和comp（p=0.0001）基因的表達顯著降低（圖3C）。在生長因子抑制的背景下，促合成胰島素樣生長因子-1（IGF1；p=0.0070，IGFBP2；p=0.0011）在SIRT6缺失的軟骨細胞中表達顯著下調（IGF1；p=0.0070，IGFBP2；p=0.0011）。上游調控分析表明，IGF-1的下調預計會抑制我們數據集中發現的各種促合成軟骨基因，包括COL2A1和IGFBP2（圖3D）。在核糖核酸測序數據集中其他顯著下調的基因包括Sirt6（p=0.0011），Wnt抑制物SFRP1（p=0.0048）和SFRP4（p=0.0002），以及著名的SIRT6調節的代謝和壽命調節因子PCK1（p=0.005）（圖3C）。相反，缺乏SIRT6導致促進分解代謝的IL1RL1和HHIP基因顯著增加，當增強時，這兩個基因與OA的進展和發展有關。這些效應也通過定量逆轉錄聚合酶鏈式反應（IL1RL1；p=0.0121，HHIP；p=0.0008）得到驗證（圖3A和C）。
       綜上所述，這些結果表明，SIRT6的缺失顯著降低了IGF-1基因和包括COL2A1在內的一系列ECM基質基因的表達，并促進了與OA相關的促分解代謝基因的基因表達。由于IGF-1信號在維持軟骨細胞外基質和軟骨細胞存活中起著關鍵作用，這些結果促使我們進一步探索SIRT6/IGF-1軸在軟骨細胞中的作用。

圖3 Sirt6缺失的人軟骨細胞的RNA測序分析

4.SIRT6對人軟骨細胞中IGF-1信號的調控

       為了評估Sirt6缺陷對IGF-1信號轉導的影響，本研究對Sirt6完整和Sirt6缺陷小鼠的股骨頭軟骨進行了解剖和體外培養。用4-羥基他莫昔芬處理外泌體96小時，以誘導Cre介導的Sirt6缺失，然后提取軟骨細胞并進行免疫印跡處理，以檢測IGFBP2和磷酸化的Akt，作為IGF-1信號通路激活的標志。與Sirt6完整的股骨頭外植體相比，缺失Sirt6的外植體顯示基礎IGFBP2（p=0.0112）和磷酸化Akt^ser473（p=0.0229）蛋白水平顯著降低（圖4A）。對來自我們的數字MM研究中的Sirt6完整和Sirt6缺失的假對照組小鼠的關節組織切片進行的免疫組化研究表明，與Sirt6完整的對照組相比，Sirt6缺陷的小鼠軟骨中胰島素樣生長因子-1的水平顯著降低（p=0.0002），這與我們在Sirt6基因敲除的人軟骨細胞中的RNA測序數據一致（圖4B）。
       由于Sirt6缺乏降低了小鼠軟骨中的IGF-1/Akt軸，我們接下來的目標是測試SIRT6激活對軟骨細胞中IGF-1信號轉導的影響。用編碼SIRT6的腺病毒載體（24小時）轉導原代人軟骨細胞以增加SIRT6的活性，或如前所述的空載體（空）對照。與空載體對照相比，SIRT6過表達顯著增加了Akt在Ser⁴⁷³（p=0.0178）和Thr³⁰⁸（p=0.0003）處的基礎磷酸化，并增加了Akt活性的標志--富含Pro的Akt底物的磷酸化（p=0.0249）（圖4C）。接下來，我們用SIRT6的小分子激活劑MDL800處理原代人類軟骨細胞，此前已有研究表明，它可以將SIRT6的活性提高22倍。我們分離了軟骨細胞組蛋白，并對SIRT6底物的乙酰化形式H3K9（H3K9ac）進行了免疫印跡，H3K9ac是SIRT6活性的反向標記。用MDL-800（12.5微米，24小時）處理軟骨細胞后，H3K9的基礎乙酰化形式顯著減少（p=0.0001），表明與對照組相比，SIRT6活性增強。在總細胞裂解物中，MDL800誘導的SIRT6激活導致基礎磷酸化Akt^ser473和磷酸化PRAS40顯著增加，并在處理3小時時達到峰值（分別為p=0.0170，p=0.0120）（圖4D）。在研究的時間過程中，SIRT6蛋白水平沒有隨著MDL-800的處理而改變，這與其他研究結果一致。總之，這些功能獲得和功能喪失的研究表明，SIRT6是小鼠和人類軟骨細胞中促合成代謝的IGF-1信號通路的關鍵調節因子，并減少與骨關節炎相關的分解代謝信號事件。

圖4 SIRT6調節軟骨細胞中的胰島素樣生長因子-1（IGF-1）信號

實驗方法
H&E染色、免疫印跡、RT-qPCR
參考文獻
Collins, J. A. et al. Cartilage-specificSirt6deficiency represses IGF-1 and enhances osteoarthritis severity in mice. Annals of the Rheumatic Diseases, 2023 doi:10.1136/ard-2023-224385 (2023).