長鏈非編碼RNA（lncRNA）在正常組織和癌癥基因調控中發揮重要作用。靶向lncRNAs是一種有前景的治療方法，通過開發間隙反義寡核苷酸（ASO）使其變得可行。轉移相關肺腺癌轉錄物（MALAT1）是一種豐富的lncRNA，其表達在多種癌癥中上調。盡管Malat1增加了腫瘤細胞的遷移和侵襲特性，但其在腫瘤微環境（TME）中的作用尚未得到很好的定義。作者使用幾種免疫活性臨床前同系Tp53-null三陰性乳腺癌（TNBC）小鼠模型探索Malat1與腫瘤免疫微環境（TIME）之間的聯系，這些模型模擬了人類乳腺癌中發現的異質性和免疫抑制性TME。使用Malat1 ASO能夠敲低Malat1 RNA表達，導致原發性腫瘤生長延遲、增殖減少和凋亡增加。此外，腫瘤浸潤淋巴細胞的免疫表型顯示，Malat1抑制隨著時間的推移而改變，免疫抑制性腫瘤相關巨噬細胞（TAM）和髓系衍生抑制細胞（MDSC）減少以及細胞毒性CD8⁺T細胞增加。腫瘤細胞、TAM和MDSC中Malat1消耗減少免疫抑制細胞因子/趨化因子的分泌，其中T細胞Malat1抑制增加了炎性分泌和T細胞增殖。Malat1 ASO與化療或免疫檢查點阻斷（ICB）組合改善了臨床前模型中的治療反應。這些研究強調了Malat1抑制在TNBC中的免疫刺激作用、Malat1 ASO治療的益處以及其與化療和免疫治療聯合使用的潛力。該研究于2023年9月發表在《Cancer Immunol Res》，IF：10.1。

技術路線

主要研究內容

1. 單劑Malat1 ASO延遲TNBC臨床前小鼠模型中原發性腫瘤生長

       為確定Malat1抑制對體內乳腺腫瘤進展的影響，作者使用了已建立的同系Tp53-null源自BALB/c小鼠模型，其概括了TNBC的攻擊性和異質性。使用富含中性粒細胞的2208 L luminal腫瘤亞型和富含巨噬細胞的T12和T11 Claudin低腫瘤亞型，因為它們具有高度免疫抑制性的髓細胞區室，這有助于腫瘤發生、轉移和對可用治療的耐藥性。Gapmer ASOs允許Malat1靶向降解，并且在先前研究中已經證明可以有效實現敲低。WT BALB/c小鼠將Tp53-null腫瘤塊植入乳腺脂肪墊中，一旦可觸及，就連續5天皮下注射Malat1靶向ASO或scramble對照ASO，并給予2天藥物假期（圖1A）。治療5天后，Malat1 ASO導致約60%-75%的Malat1 RNA表達減少，該表達使用5天和2天休息治療方案維持（圖1B和C）。Malat1抑制導致T12和2208L腫瘤中原發性腫瘤生長延遲，治療14天后，兩種模型的腫瘤體積均顯著減少（圖1D和E）。在2208L和T11長期治療研究中，Malat1抑制維持了2208 L荷瘤小鼠的腫瘤進展延遲。腫瘤切片IHC染色顯示，Malat1 ASO處理的腫瘤具有增殖標記物磷酸組蛋白3的染色減少和細胞凋亡增加，如切割的caspase 3染色增加所示（圖1F）。這些結果表明，由于細胞死亡增加和細胞增殖減少，使用ASO特異性靶向Malat1和隨后的Malat1抑制導致腫瘤體積減小。

圖1：單劑Malat1 ASO延遲TNBC臨床前小鼠模型中原發性腫瘤生長

2. Malat1抑制降低了TME中免疫抑制性骨髓細胞

       Malat1先前已被證明通過增加腫瘤細胞增殖和侵襲來促進癌癥的進展，但對TIME的影響知之甚少。為研究Malat1敲低對TIME的影響，從Malat1 ASO治療14天的T12和2208L腫瘤中分離腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL），并使用流式細胞術對髓細胞標志物進行定量（圖2A和E）。Malat1缺失的T12 Claudin低腫瘤是高度富集巨噬細胞腫瘤，該腫瘤減少了F4/80⁺巨噬細胞。此外，在存在的巨噬細胞中，CD206⁺ 精氨酸-1（Arg-1）⁺ F4/80⁺細胞增加，他們是免疫抑制M2樣巨噬細胞的代表（圖2B和D）。相反，CD86⁺ F4/80細胞略有增加，CD86是M1樣巨噬細胞存在的炎癥標志物（圖2C）。在高度富集中性粒細胞的2208L腫瘤中，Malat1抑制導致粒細胞MDSC（G-MDSC）的Cd11b+Ly6C^lowLy6G^high細胞減少（圖2F）。以Cd11b⁺Ly6C^highLy6G^low為特征的單核細胞MDSC（M-MDSC）區室在治療組之間沒有顯示出顯著差異（圖2G）。先前研究表明，當一個髓細胞群體被耗盡時，在單獨的髓細胞群體中可能存在補償性富集，但在Malat1 ASO治療中，作者觀察到2208L腫瘤中Arg-1⁺巨噬細胞也減少（圖2H）。腫瘤切片用F4/80和中性粒細胞標記物S100a8染色，以闡明髓細胞空間分布。IHC顯示骨髓細胞廣泛分布在整個腫瘤中，T12腫瘤中存在大量巨噬細胞，2208 L腫瘤中存在更多中性粒細胞。Malat1缺失的腫瘤F4/80和S100a8染色均減少（圖2I）。

       為確定可能導致骨髓細胞群減少的腫瘤內在效應，用Malat1 ASO處理腫瘤來源的T12和2208L細胞系，并收集上清使用炎性細胞因子/趨化因子試驗進行分析。兩種細胞系中的Malat1缺失改變了腫瘤分泌譜。在T12癌細胞中，募集免疫抑制巨噬細胞和中性粒細胞募集到腫瘤部位的趨化因子減少（圖2J）。在Malat1 ASO處理的腫瘤細胞中，有助于募集M1樣巨噬細胞到TME的炎性趨化因子Cxcl9和Cxcl10也減少，這為腫瘤細胞Malat1抑制不負責將巨噬細胞復極為更具炎癥表型提供證據。類似于T12，Malat1 ASO處理的2208L腫瘤細胞中免疫抑制細胞因子/趨化因子分泌減少。趨化因子Cxcl1、Gm-csf和Tnfa降低，同時Ccl5和細胞因子IL6顯著降低。已知這些因素可促進MDSCs的募集和發展并支持免疫抑制。Vegf是血管生成和髓細胞富集的啟動子，在兩種細胞系中均減少（圖2J）。這些分析表明，Malat1抑制降低了TNBC微環境中免疫抑制免疫細胞的頻率，腫瘤細胞分泌譜發生一致性變化，導致骨髓細胞向原發性腫瘤的募集減少。然而，由于兩個骨髓細胞室都沒有完全消除，作者接下來檢查了剩余骨髓細胞的功能。

圖2：Malat1抑制降低TME中的免疫抑制性骨髓細胞

3. Malat1抑制降低了TAM和MDSC的免疫抑制功能

       在確定腫瘤細胞中Malat1缺失可以影響免疫抑制性骨髓細胞向TME募集之后，作者接下來想了解Malat1抑制對TAM和MDSC功能的影響。分別從T12和2208L腫瘤中提取的TAMs和MDSCs均具有豐富的Malat1 RNA表達，這與腫瘤細胞相當。單細胞測序研究表明，在與腫瘤細胞直接接觸前和直接接觸后，從外周血單核細胞中收集的中性粒細胞在遇到腫瘤時表現出Malat1表達增加，表明Malat1可能在中性粒細胞的腫瘤教育中發揮作用。這使作者更詳細地研究了Malat1缺失可能對骨髓細胞產生的內在影響。為確定Malat1 ASO是否能夠有效敲低T12原發性腫瘤分離出的TAMs和2208L原發性瘤分離出的MDSCs中的Malat1，在250 nmol/L ASO存在下體外培養72小時。在這兩種類型細胞中，Malat1 RNA表達在體外顯著降低（圖3A和4A）。此外，從T12腫瘤提取的TAMs（圖3B）和從2208L腫瘤提取的MDSCs（圖4B）在ASO治療5天后顯示出Malat1 RNA表達顯著敲低，證實該治療方案降低了骨髓細胞和腫瘤細胞中Malat1表達。

       為確定TAM功能的變化，將從T12腫瘤中分離的TAM與從WT BALB/c小鼠脾臟中分離的CD3/CD28刺激的T細胞在體外培養。250 nmol/L ASO濃度導致60%至80%的TAMs敲低，但T細胞沒有敲低，并且當用該濃度的ASO單獨培養T細胞時，增殖沒有發生變化。T細胞與Malat1缺失TAMs共培養72小時，這增加了細胞增殖，如CFSE表達降低（圖3C和D），同時CD8⁺ T細胞增殖顯著增加，而CD4⁺ T細胞增殖沒有變化（圖3E和F）。類似地，當從Malat1 RNA表達降低的2208L腫瘤中分離的MDSCs與活化的T細胞共培養時，CD8⁺ T細胞增殖增加（圖4C-F）。

       為評估Malat1缺失的髓系細胞對T細胞殺傷能力的影響，在250 nmol/L ASO存在下，將從T12原發性腫瘤分離的TAMs或MDSCs與GFP標記的T12腫瘤衍生細胞系和從JEDI小鼠脾臟分離的GFP特異性T細胞以1:1:1比例孵育，T細胞：TAM：腫瘤細胞5:5:1比例孵育，T細胞∶MDSC：腫瘤細胞1:1:1比例孵育。使用Incucyte每2小時拍攝細胞照片和GFP信號（圖3G和4G）。流式細胞術分析殘留細胞，在Malat1 ASO處理的TAM共培養物中，細胞死亡標志物Annexin V沒有發生變化（圖3H）。同樣，T細胞中觀察到具有細胞毒性T細胞標記物Granzyme B和Perforin的CD8⁺細胞增加（圖3I和J）。Malat1缺失的MDSC共培養中T細胞毒性增加，如Annexin V⁺腫瘤細胞的顯著增加以及Granzyme B⁺ CD8⁺ T細胞和Perforin⁺ CD8 ⁺ T細胞增加（圖4H–J）。在沒有T細胞的情況下，TAMs和MDSCs與腫瘤細胞共培養作為補充對照。從TAM 5:5:1和MDSC 1:1:1共培養物中收集到的上清趨化因子/細胞因子分析顯示，其分泌特征與腫瘤細胞相似，如觀察到的免疫抑制趨化因子減少，兩種細胞類型的共培養物中，Il10顯著減少（圖3K和4K）。在存在腫瘤細胞的情況下，Malat1 ASO處理的培養物中也觀察到Ifnγ分泌減少，這表明Malat1抑制降低了TAMs和MDSCs整體炎性特征，其中包括免疫抑制因子減少。這些結果表明，在TNBC中，隨著Malat1敲低，髓系細胞功能發生變化。此外，原代TNBC-TME中Malat1抑制通過降低TAMs和MDSCs對T細胞的抑制作用，有助于創造一個更具有免疫刺激性的環境，這可能會增加T細胞反應。這些結果使作者研究了Malat1 ASO治療后對TME中T細胞的影響。

圖3：Malat1抑制降低TAM免疫抑制功能

圖4：Malat1抑制降低MDSC免疫抑制功能

4. Malat1抑制增加了TME中T細胞浸潤

       一旦確定Malat1敲低對TME中骨髓細胞群的影響，作者使用從T12和2208L原發性腫瘤中分離的TIL來研究Malat1缺失對T細胞浸潤的影響，并使用流式分析進行定量（圖5A）。在2208L腫瘤中，觀察到表達細胞毒性標志物Granzyme B和Ifnγ的CD8⁺ T細胞數量增加（圖5B-D）。CD4⁺ T細胞群也減少，這與免疫抑制調節性Foxp3⁺ CD4⁺ T細胞顯著減少相吻合（Tregs，調節性T細胞；圖5E和F）。在T12腫瘤中，Granzyme B⁺ T細胞浸潤顯著增加，而總體CD8⁺ T細胞浸潤沒有變化（圖5G和H）。T12腫瘤包含更少的CD4⁺ T細胞群，并且沒有觀察到Tregs顯著變化（圖5I和J）。對腫瘤切片進行CD8α和Foxp3 IHC染色，以確定這些細胞的空間分布。在2208L腫瘤間質中發現許多T細胞，盡管Malat1 ASO處理腫瘤顯示CD8α染色增加，與Scramble ASO處理腫瘤相比，在其間質外發現更多的細胞（圖5K）。與Scramble相比，Malat1 ASO處理的T12腫瘤中CD8a染色也略有增加（圖5K）。Foxp3染色稀疏，然而，定量顯示在兩種腫瘤模型中，Malat1 ASO治療后Foxp3減少（圖5K）。對原發性腫瘤TIL分析有助于支持Malat1抑制產生更具有免疫刺激性的TME并增加細胞毒性T細胞浸潤的結論。為確定Malat1耗竭后免疫刺激性TME增加對腫瘤進展的影響程度，作者在T細胞缺陷小鼠中進行一系列治療研究。將2208L腫瘤塊植入不具有CD8或CD4 T細胞的Nude無胸腺小鼠乳腺脂肪墊中，并用Malat1 ASO或Scramble對照處理。在該T細胞缺陷模型中，盡管ASO治療顯著降低Malat1表達，但治療組之間的腫瘤生長沒有變化。使用CD8α特異性抗體的初步研究成功消融了循環CD8⁺ T細胞，它顯示出治療組之間原發性腫瘤生長沒有顯著變化，同時腫瘤中Malat1 RNA表達顯著降低。相反，用IgG和Malat1 ASO處理的小鼠腫瘤體積減少，但由于樣本量小，這在統計學上并不顯著。這些結果強調了TME在小鼠模型中腫瘤反應中的重要性，并且改變免疫微環境，特別是增加T細胞浸潤，足以延緩腫瘤進展。

圖5：Malat1抑制增加TME中的T細胞浸潤

5. T細胞中Malat1抑制增加了細胞增殖和細胞毒性

       盡管組織勻漿樣品中Ifnγ增加，但T12和2208L腫瘤細胞中Malat1缺失并沒有增加細胞的免疫刺激性細胞因子分泌。體內觀察到的細胞毒性T細胞浸潤增加是否部分是由T細胞內在變化引起的呢？為研究Malat1耗竭對T細胞的影響，作者使用體外培養和共培養實驗。通過陰性選擇從WT BALB/c小鼠脾臟中分離CD3⁺ T細胞，并用CD3/CD28活化珠刺激3至5天。在培養的第2天和第4天將Malat1和Scramble ASOs（各500nm）加入孔中。所使用的ASO濃度可以有效將Malat1表達減少至少50%。qPCR分析顯示，當用ASO處理T細胞兩次時，Malat1 RNA表達顯著敲低，培養5天后Malat1消耗更大（圖第6A段）。為確定Malat1敲低對T細胞增殖的影響，在接種前用CFSE對T細胞進行染色。3天后，與Scramble ASO處理的T細胞相比，Malat1 ASO處理過的T細胞中CFSE降低（圖6B），表明其增殖增加。培養3-5天的Malat1耗竭T細胞的流式分析顯示，培養3天后CD8⁺ T細胞群略有增加，5天后差異不太明顯（圖6C）。在檢查細胞毒性標記物時，發現Granzyme B⁺和Perforin⁺ CD8⁺細胞在培養3天后適度增加，在培養5天后保持不變（圖6D和E）。

       為進一步研究Malat1抑制對細胞毒性的影響，將從WT JEDI小鼠脾細胞中分離的GFP特異性T細胞與GFP標記的T12細胞以1:1和5:1的效應物：靶目標培養約48小時，并使用Incuyte進行監測。在1:1的效應比下，分析殘留的腫瘤細胞，并對Annexin V⁺ 腫瘤細胞進行定量。在效應比例為5:1時，收集到的殘余腫瘤細胞數量可以忽略不計，因此選擇通過測量每個孔中剩余的GFP信號來評估細胞毒性。Malat1缺失T細胞顯示出腫瘤細胞殺傷增加，Granzyme B和Perforin細胞毒性標記物以5:1比例略有增加（圖6F-J）。未用ASO處理的共培養物，連同單獨培養的T細胞和單獨培養的腫瘤細胞都用作對照組。從這些共培養物中收集到的上清細胞因子分析顯示，Malat1 ASO處理的T細胞炎性細胞因子分泌增加，包括腫瘤或髓系細胞中未發現的Ifnγ和Tnfα增加。與骨髓細胞群不同，免疫抑制細胞因子/趨化因子分泌沒有顯著變化（圖6K）。這些發現強調了通過Malat1抑制來提高T細胞細胞毒性的潛力，同時也強調了Malat1在效應T細胞中與骨髓細胞和腫瘤細胞相比所起的不同作用。在T細胞中觀察到炎癥增加，而在TAMs、MDSCs或腫瘤細胞中沒有觀察到。用Malat1 ASO處理的T細胞可能在離體環境中用于改善治療反應。

圖6：T細胞中Malat1抑制增加了細胞增殖和細胞毒性

6. Malat1 ASO聯合化療或ICB改善臨床前小鼠模型反應

       單劑Malat1 ASO治療對2208 L和T12腫瘤的預期效果，特別是隨著時間推移看到的增強免疫刺激效應，使作者研究了將ASO與化療和ICB等既定臨床療法相結合的潛在益處。植入2208L腫瘤的BALB/c小鼠被隨機分為四個單獨治療隊列：臨床相關劑量為25 mg/kg的Carboplatin與Scramble ASO， 25 mg/kg Carboplatin與Malat1 ASO，10 mg/kg抗PD1與Scramble ASO，10 mg/kg抗PD1與Malat1 ASO。一小群小鼠單獨用亞型匹配IgG抗體治療，作為ICB治療組的單獨對照。小鼠使用既定的治療方案進行治療（圖7A）。在兩個聯合治療組中，原發性腫瘤生長和腫瘤體積均顯著延遲，收集到的腫瘤重量顯著減少（圖7B和C）。盡管沒有通過聯合治療實現腫瘤停滯或消退，但能夠延長小鼠在高度侵襲性腫瘤中的生存期（圖7D和E）。值得注意的是，與IgG對照組相比，用單劑ICB治療的小鼠沒有任何反應，但與Malat1 ASO聯合治療后，小鼠存活時間顯著延長。

       在這些治療組中，從原發性腫瘤分離的TIL免疫表型分析概括了單劑治療后T細胞群變化，細胞毒性Granzyme B⁺ CD8⁺ T細胞增加，Tregs減少（圖7F-M）。與單劑ASO或化療治療組相比，單劑ICB治療的腫瘤調節性Foxp3⁺ CD4⁺ 細胞增加，但Malat1 ASO與ICB聯合使用顯著降低了這種免疫抑制性T細胞群（圖第7I和M）。這些治療組中的IHC染色支持TIL流式分析中觀察到的結果，與單劑治療相比，在Malat1 ASO聯合治療的腫瘤基質區域內外發現更多的CD8⁺ T細胞。這些結果突出了將Malat1 ASO與常見臨床可用療法相結合使用的潛力，并且當與正確的分期參數一起使用時，TME中的免疫浸潤可能會提高化療和ICB療效。

圖7：Malat1 ASO聯合化療或ICB改善臨床前小鼠模型的反應

結論

       本研究利用gappmer ASO成功靶向lncRNA Malat1，并闡明了Malat1缺失在兩種不同的體內TNBC模型中的影響。使用Malat1 ASO能夠敲低Malat1 RNA表達，導致原發性腫瘤生長延遲、增殖減少和凋亡增加。此外，Malat1抑制減少了免疫抑制性TAM和MDSC以及增加了細胞毒性CD8⁺T細胞。Malat1 ASO與化療或免疫檢查點阻斷（ICB）組合改善了臨床前模型中的治療反應。這些研究強調了Malat1抑制在TNBC中的免疫刺激作用，以及Malat1 ASO與化療和免疫治療聯合使用的潛力。

實驗方法

細胞培養，ASO轉染，RT-qPCR，IHC染色，流式細胞術，T細胞增殖試驗，單細胞測序

參考文獻

Adewunmi O, Shen Y, Zhang XH, Rosen JM. Targeted inhibition of lncRNA Malat1 alters the tumor immune microenvironment in preclinical syngeneic mouse models of triple negative breast cancer. Cancer Immunol Res. 2023 Aug 21:CIR-23-0045. doi: 10.1158/2326-6066.CIR-23-0045. Epub ahead of print. PMID: 37603945.