骨關節(jié)炎（OA）是一種與年齡相關的代謝性疾病。低度炎癥和氧化應激是OA最后的常見途徑。α-酮戊二酸（α-KG）是線粒體三羧酸（TCA）循環(huán)中必需的生理代謝產物，具有抗炎和抗氧化等多種功能，并且隨著年齡的增長，血清水平會降低。本研究旨在探討α-KG對骨性關節(jié)炎的治療作用及其機制。作者首次定量檢測了α-KG在IL-1β誘導的人軟骨組織和骨關節(jié)炎軟骨細胞中的表達水平。此外，對IL-1β誘導的骨關節(jié)炎軟骨細胞用不同濃度的α-KG進行處理。分析軟骨細胞的增殖和凋亡、細胞外基質的合成和降解以及炎癥介質。用核糖核酸測序的方法探討α-KG的作用機制，并進一步檢測吞噬作用和氧化應激水平。這些結果在前交叉韌帶切斷（ACLT）誘導的年齡相關性骨關節(jié)炎大鼠模型中得到了驗證。作者發(fā)現(xiàn)損傷的內側軟骨α-KG含量比正常外側軟骨減少了31.32%，IL-1β誘導的人骨關節(jié)炎軟骨細胞比對照組減少了36.85%。α-KG可逆轉IL-1β誘導的軟骨細胞增殖抑制和細胞凋亡，增加ACAN和COL2A1的轉錄和蛋白表達，但抑制MMP13、ADAMTS5、IL-6和TNF-α的表達。在機制上，α-KG促進有絲分裂，抑制ROS的產生，這種作用可被Mdivi-1（有絲分裂抑制物）所阻斷?？傮w而言，α-KG在人骨關節(jié)炎軟骨和IL-1β誘導的骨關節(jié)炎軟骨細胞中的含量減少。此外，補充α-KG可通過調節(jié)線粒體自噬和氧化應激來減輕骨關節(jié)炎的表型，提示其有可能成為改善骨關節(jié)炎的治療靶點。本文于2023年6月發(fā)表于期刊《Redox Biology》，IF=11.4

主要技術路線

主要研究結果

1、人骨關節(jié)炎軟骨中α-KG含量及IL-1β對軟骨細胞增殖和凋亡的影響

       α-KG是戊二酸的酮基衍生物之一（圖1A），戊二酸來自異檸檬酸，在生理上產生丁二酰輔酶A（圖1B）。因此，作者首先檢測了α-KG在IL-1β誘導的人軟骨組織和軟骨細胞中的含量（圖1C）。結果表明，損傷內側軟骨α-KG含量較正常外側軟骨降低31.32%（P<0.0821，圖1D），人軟骨細胞經IL-1β處理24 h后含量下降36.85%，但差異無統(tǒng)計學意義（P=0.0821，圖1E）。然后，檢測α-KG對原代人軟骨細胞的影響。CCK-8實驗顯示，當α-KG濃度小于2 mM或作用時間小于72h時，對軟骨細胞活力無明顯影響（P<0.05，圖1F，G）。因此，作者觀察了2 mM α-KG作用24 h對IL-1β誘導的人軟骨細胞增殖和凋亡的影響。EDU結果顯示，IL-1β可抑制原代培養(yǎng)的人軟骨細胞的增殖，而α-KG可逆轉這一作用（圖1H和I）。流式細胞儀檢測顯示，IL-1β可促進原代培養(yǎng)的人軟骨細胞的凋亡，α-KG也可在一定程度上減輕這一作用（圖1J和K）。

圖1 α-KG含量及其對IL-1β誘導的軟骨細胞增殖和凋亡的影響

2、α-KG對IL-1β誘導的軟骨細胞骨性關節(jié)炎表型的影響

       除軟骨細胞外，細胞外基質（ECM）是軟骨組織的另一個主要成分。因此，采用RT-qPCR方法檢測基質合成相關基因（ACAN和COL2A1）和降解相關基因（MMP13和ADAMTS5）在轉錄水平的表達。結果表明，α-KG以濃度依賴的方式促進IL-1β誘導的骨關節(jié)軟骨細胞ACAN和COL2A1 mRNA的表達，抑制MMP13和ADAMTS5的表達（P<0.05，P<0.01，圖2A-D）。IF染色和免疫印跡結果顯示，α-KG以濃度依賴的方式促進IL-1β誘導的人軟骨細胞COL2A1蛋白表達，抑制MMP13蛋白表達（P<0.01，圖2E-G）。進一步檢測α-KG對炎癥介質的影響。RT-qPCR法和Western印跡結果顯示，IL-1β可濃度依賴性地上調人軟骨細胞IL-6和TNF-α的轉錄和蛋白表達水平，而α-KG則以濃度依賴的方式降低IL-6和TNF-α的轉錄和蛋白表達水平（P<0.05，P<0.01，圖2G-I）。

圖2 α-KG對IL-1β誘導的人軟骨細胞基質合成、降解及炎癥反應的影響

3、α-KG對骨關節(jié)炎軟骨細胞線粒體自噬和ROS生成的影響

       為了探討α-KG減輕骨性關節(jié)炎表型的機制，對其進行了測序。測序結果表明，與對照組相比，IL-1β處理組降低了與基質合成相關的基因（ACAN和COL2A1）的轉錄表達，上調了與基質降解（如MMP3、MMP9、MMP10、MMP13、ADAMTS1、ADAMTSL1、ADAMTS5、ADAMTS7和ADAMTS8）和炎癥介質相關基因（如IL-1α、IL-1R、IL-6、IL-6R、NFKBIA、TNFRSF9和TNFRSF15）的表達（圖3A）。然而，與單獨處理IL-1β相比，α-KG與IL-1β聯(lián)合作用上調了與基質合成相關的基因（COL2A1），下調了與基質降解（如MMP9、MMP13、ADAMTS1、ADAMTSL2、ADAMTS5、ADAMTS6、ADAMTS9和ADAMTS12）和炎癥介質（IL-6ST、IL-6R、NFKBIA、TNFSF8和TNFSF15）相關基因的表達（圖3B）。有趣的是，與線粒體自噬相關的基因表達的變化與與基質合成、降解和炎癥介質相關的基因的表達一致。IL-1β降低PINK1、ATG4D和JUN的轉錄表達，而α-KG增加PINK1、PARKIN、ATG4D、JUN、TOMM7和DAPK2的表達（圖3A和B）。KEGG分析還顯示了與炎癥、增殖、凋亡、氧化磷酸化和有絲分裂相關的通路的變化（圖3C）。

       因此，進一步用透射電子顯微鏡檢測有絲分裂吞噬作用。結果顯示，IL-1β誘導的軟骨細胞線粒體形態(tài)正常、規(guī)則、完整，但腫脹、空泡化、密度降低、結構不完整。α-KG的加入改善了線粒體結構，促進了線粒體自噬，從而增加了IL-1β誘導的軟骨細胞中受損線粒體的清除（圖3D）。免疫熒光共定位顯示α-KG增加了IL-1β誘導的人軟骨細胞中線粒體和溶酶體的相互作用（P<0.05，P<0.01，圖3E）。Bafilomycin A1，可以通過抑制溶酶體酸化阻止晚期自噬通量，被進一步測定自噬通量。結果顯示，α-KG顯著增加IL-1β誘導的骨關節(jié)炎軟骨細胞的自噬通量（P<0.01）。RT-qPCR和western blot也證實α-KG上調了線粒體自噬標志物（PINK1和Parkin）相關基因的表達（P < 0.05, P < 0.01，圖4A, B）。最后，檢測線粒體功能。結果表明，α-KG處理顯著提高了IL-1β誘導的軟骨細胞基礎呼吸、最大呼吸、ATP相關的線粒體呼吸和備用呼吸能力（P < 0.05, P < 0.01）。同時，α-KG也能降低IL-1β誘導的人軟骨細胞中ROS的生成（P < 0.05, P < 0.01，圖4C）。提示α-KG增加骨關節(jié)炎軟骨細胞的線粒體自噬，改善線粒體功能，抑制ROS生成。

圖3 α-KG對IL-1β誘導的人軟骨細胞線粒體自噬的影響

4、Mdivi-1對軟骨細胞α-KG活性的影響

       已經證實Mdivi-1是一種線粒體自噬抑制劑。為了進一步探討線粒體自噬在介導α-KG對IL-1β誘導的人軟骨細胞骨關節(jié)炎表型的緩解作用中的作用，作者采用Mdivi-1聯(lián)合α-KG治療IL-1β誘導的軟骨細胞。TEM和IF結果顯示，α-KG和Mdivi-1抑制了線粒體和溶酶體共定位，改善了線粒體形態(tài)，增加了ROS的產生（P < 0.05, P < 0.01，圖3D和E，4C）。α-KG與Mdivi-1聯(lián)用也降低了PINK1和Parkin的轉錄組和蛋白表達（P < 0.05, P < 0.01，圖4A，B），這些結果表明Mdivi-1逆轉了α-KG對線粒體自噬的影響。

       用EdU和流式細胞術檢測軟骨細胞的增殖和凋亡情況，發(fā)現(xiàn)Mdivi-1可以抵消α-KG促進增殖和抑制細胞凋亡的作用（且有增強的趨勢）（P = 0.0564, P < 0.01，圖1H-K）。補充α-KG后，藏紅花O染色增強，但可被MDVI-1抑制（P<0.01，圖4D）。RT-qPCR結果顯示，Mdivi-1逆轉了α-KG誘導的人軟骨細胞基質合成相關基因（ACAN和COL2A1）轉錄表達增加（P<0.05，P<0.01，圖4E和F），基質降解相關基因（MMP13和ADAMTS5） （P<0.05，P<0.01，圖4G），以及炎性介質（IL-6和TNF-β）表達降低（P<0.01，圖4H和I）。Western印跡和進一步證實Mdivi-1可抑制COL2A1蛋白表達的增加和MMP13、IL-6和TNF-α的表達降低（P=0.0559，P<0.05，P<0.01，圖4J）。

圖4 Mdvi-1對人軟骨細胞α-KG活性的影響

5、補充α-KG對大鼠骨性關節(jié)炎表型的影響

       為進一步評價α-KG的作用，采用ACLT建立大鼠骨性關節(jié)炎模型。番紅O-固色綠染色顯示，α-KG修復后，ACLT可引起軟骨脫落、潮標中斷或消失、軟骨纖顫、軟骨裂隙和侵蝕、軟骨變薄和OARSI評分增加（P<0.01），這些可由α-KG恢復（P < 0.01，圖5A和B）。RT-qPCR顯示，與對照組相比，ACLT可下調軟骨基質合成相關基因（ACAN和COL2A1）的表達水平，上調與基質降解相關的基因（MMP13和ADAMTS5）和炎癥介質（IL-6和TNF-α）的基因表達水平，而ACLT+α-KG組則相反（P<0.05，P<0.01，圖5C-H）。免疫組化進一步證明，α-KG逆轉了ACLT誘導的COL2A1蛋白表達下降和MMP13水平升高（P<0.01，圖5I，J）。

圖5 補充α-KG對大鼠骨性關節(jié)炎模型的影響

6、補充α-KG對軟骨組織線粒體自噬的影響

       最后，對軟骨組織進行線粒體自噬實驗。透射電子顯微鏡顯示，ACLT+α-KG組線粒體腫脹、空泡化、結構不完整，線粒體形態(tài)正常、規(guī)則、完整（圖6A）。RT-qPCR和IHC證實人骨關節(jié)炎軟骨組織中PINK1和Parkin的轉錄表達和Parkin的蛋白水平降低（P<0.05，P<0.01，圖6B，C）。在ACLT誘導的大鼠骨性關節(jié)炎軟骨組織中，PINK1和Parkin的轉錄和蛋白表達也持續(xù)下降（P<0.05，P<0.01，圖6D-G）。然而，α-KG可逆轉上述作用（P<0.05，P<0.01，圖6D-G）。上述結果表明，α-KG可降低骨關節(jié)炎大鼠軟骨組織的線粒體自噬水平，并促進其軟骨組織的線粒體自噬作用。

圖6 補充或不補充α-KG的人OA軟骨和ACLT誘導的大鼠OA模型中線粒體自噬的變化

       總體而言，這項研究證實，在人OA軟骨和IL-1β誘導的骨關節(jié)炎軟骨細胞中，α-KG（線粒體TCA循環(huán)的一種生理代謝產物）的含量降低。此外，補充α-KG可以促進軟骨細胞增殖和凋亡抑制，逆轉體內外細胞外基質合成減少和降解增加以及炎癥反應，減少氧化應激。這是由α-KG促進軟骨細胞和軟骨組織線粒體自噬的能力介導的。此外，線粒體自噬抑制劑Mdivi-1可以抑制α-KG的作用。簡而言之，作者的研究結果提供了迄今為止未記錄的α-KG在維持軟骨穩(wěn)態(tài)中的作用證據，表明它可以成為OA的潛在治療靶點和藥物。

實驗方法

CCK-8、EdU檢測、流式細胞術、蛋白質印跡、RT-qPCR、免疫組化、RNA測序、大鼠實驗

參考文獻

L. Liu, W. Zhang, T. Liu, Y. Tan, C. Chen, J. Zhao, H. Geng, C. Ma, The physiological metabolite α-ketoglutarate ameliorates osteoarthritis by regulating mitophagy and oxidative stress, Redox Biology 62 （2023）.