肝細胞癌（HCC）是最常見的原發性惡性腫瘤。雖然索拉非尼和瑞戈非尼已分別被批準用于晚期HCC患者的一線和二線治療，但長期治療常導致獲得性耐藥。鑒于糖酵解介導的乳酸生成可導致耐藥并損害HCC治療效果，作者研究了酮體治療對索拉非尼耐藥HCC細胞代謝變化的影響。本研究發現3-羥甲基戊二酰基輔酶a合成酶2 （HMGCS2）和酮體D-β-HB在四個索拉非尼耐藥的肝癌細胞株中差異表達。在索拉非尼耐藥的肝癌細胞中，較低的HMGCS2和β-HB水平與較多的糖酵解改變和較高的乳酸生成相關。機制上，β-HB聯合索拉非尼或瑞戈非尼可通過抑制B-raf/絲裂原活化蛋白激酶通路和間質n-鈣黏蛋白-波形蛋白軸促進索拉非尼耐藥肝癌細胞的抗增殖和抗遷移能力。該研究于2023年9月發表在《Biomarker Research》，IF：11.1。

技術路線

主要研究結果

1. 4種HCC-SR細胞株中β-HB和HMGCS2基因表達的差異

       使用四種肝癌細胞系（Huh7，Sk-Hep-1，Hep3B和HepG2），首先評估了KB （β-HB和乙酰乙酸）水平在親代細胞和獲得性索拉非尼耐藥（SR）細胞之間的差異。與親代肝癌細胞相比，在Huh7-SR和Sk-Hep1-SR細胞中β-HB表達水平較低，而在Hep3B-SR和HepG2-SR細胞中β-HB表達水平較高（圖1A）。然而，在任何肝癌細胞系中，親本細胞和SR細胞之間的乙酰乙酸水平沒有顯著差異。此外，HMGCS2基因和蛋白水平在Huh7-SR和Sk-Hep1-SR細胞中下調，在Hep3B-SR和HepG2-SR細胞中上調（圖1B，C）。根據圖1A-C，將四種HCC-SR細胞系分為低HMGCS2/β-HB水平和高HMGCS2/β-HB水平兩組。然而，乙酰輔酶a主要通過兩條途徑形成:脂肪酸的β-氧化和糖酵解（圖1D）。為了確定脂肪酸合成是否與4種肝癌細胞系中β-HB的差異水平相關，分析了脂肪酸代謝相關基因的表達。與親本細胞相比，四個HCC-SR細胞系的FAS表達沒有顯著差異，表明與乙酰輔酶a復氧化的弱相關性（圖1E）。與親本細胞相比，SCD1在四個HCC-SR細胞系中表達下調，但DGAT1的表達沒有差異（圖1E）。此外，在四個親本細胞系和它們的SR細胞系之間，沒有發現細胞內脂肪酸水平的顯著差異（圖1F）。綜上所述，這些數據表明HMGCS2和β-HB的差異水平不受脂肪酸氧化的調節。

       對1807個上調至少2倍的基因進行的富集分子相互作用網絡分析表明，索拉非尼耐藥細胞的轉移和傷口愈合網絡增加（圖2A）。為了進一步了解肝癌細胞獲得性索拉非尼耐藥過程中可能受到影響的通路類型，KEGG通路富集分析顯示，傷口愈合信號通路、GDP -葡萄糖生物合成、葡萄糖和葡萄糖-1-磷酸降解、p38 MAPK信號通路和ERK/MAPK信號通路在索拉非尼耐藥細胞中上調（圖2 B）。

圖1. 在4種HCC-SR細胞株中，不同水平的HMGCS2對β-HB的影響大于對乙酰乙酸的影響；此外，脂肪酸介導的通路與4種SR細胞株的β-HB水平無關

圖2. IPA分析索拉非尼耐藥Huh7細胞中上調的通路

2. 四種HCC-SR細胞系中不同的糖酵解移位和乳酸的產生

       糖酵解依賴的乙酰輔酶a形成是合成β-HB的另一個途徑（圖1D）。研究了四種HCC-SR細胞系中糖酵解調節分子之間的潛在關聯。與各自親本肝癌細胞株相比，四個肝癌-SR細胞株的己糖激酶I和II的蛋白水平較高，表明肝癌-SR細胞具有較高的糖酵解活性（圖3A，B）。磷酸果糖激酶在Huh7-SR和Sk-Hep-1-SR細胞中表達降低，而在Hep3B-SR和HepG2-SR細胞中表達升高（圖3A，B）。

       與各自的親本Huh7和Sk-Hep-1細胞相比，Huh7-SR和Sk-Hep-1-SR細胞的PDH蛋白水平降低（圖3A，B），而Hep3B-SR和HepG2-SR細胞的PDH蛋白水平升高。Huh7-SR和Sk-Hep-1-SR細胞的PDH mRNA水平始終低于其親本細胞（圖3C）。LDHA是一種乳酸合酶基因，在Huh7-SR和Sk-Hep-1-SR細胞中上調，但在Hep3B-SR和HepG2-SR細胞中下調（圖3A-C）。PDH和LDHA在4種HCC-SR細胞株中均有不同程度的表達。如圖2A所示，丙酮酸被LDHA轉化為乳酸。雖然與其親本HCC細胞相比，所有四個HCC-SR細胞系中的乳酸水平均增強，但Huh7-SR和Sk-Hep-1-SR細胞中的乳酸水平高3.5倍，而Hep3B-SR和HepG2-SR細胞中的乳酸水平僅高1.5倍（圖3D）。結合圖1和圖3的結果，可以將四株HCC-SR細胞分為兩組：Huh7-SR和Sk-Hep-1-SR細胞，其β-HB水平和PDH表達低于另一組，乳酸生成和LDHA表達高于另一組，即Hep3B-SR和HepG2-SR細胞。

圖3. PDH，LDHA和乳酸在四種HCC-SR細胞系中的差異表達

3. β-HB逆轉Huh7和Sk-Hep-1細胞糖酵解相關的索拉非尼耐藥

       在低水平的HMGCS2和β-HB HCC-SR細胞中觀察到高糖酵解和乳酸產生（圖1A-C）。因此研究β-HB處理是否改變Huh7-SR和Sk-Hep-1-SR細胞的糖酵解能力。β-HB處理增加Huh7-SR和Sk-Hep-1-SR細胞中PDH蛋白的表達水平，而LDHA水平沒有變化（圖4A，B）。在1%胎牛血清（FBS）培養基中培養Huh7-SR和Sk-Hep-1-SR細胞，β-HB處理顯著增強PDH和異檸檬酸脫氫酶（IDH）的表達，其中IDH是TCA循環中的限速酶，并降低LDHA的表達（圖4C，D）。檢測SR誘導的乳酸生成是否被β-HB處理逆轉。如圖4E所示，在β-HB處理的Huh7-SR和Sk-Hep-1-SR細胞中，觀察到乳酸水平的劑量依賴性降低。這些結果提示β-HB可能通過減弱糖酵解蛋白和乳酸生成改變肝癌-SR細胞的能量代謝。

圖4. β-HB處理改變Huh7-SR和Sk-Hep-1-SR細胞中PDH、LDHA和乳酸的表達水平

4. β-HB可逆轉HCC-SR細胞對索拉非尼的耐藥并增強其對瑞戈非尼的敏感性

       將不同劑量的β-HB與10 μM索拉非尼聯合處理Huh7-SR和Sk-Hep-1-SR細胞。如圖5 A所示，β-HB處理后細胞活力明顯降低，且呈劑量依賴性。進一步用5 μM的瑞戈非尼聯合β-HB處理HCC-SR細胞。β-HB顯著增強了瑞戈非尼對HCC-SR細胞的細胞毒性（圖5B）。為進一步闡明與β-HB和瑞戈非尼共同處理的SR細胞活性抑制相關的機制，分析MAPK介導的增殖和凋亡狀態的抑制。瑞戈非尼處理后，B-raf、MEK和細胞外信號調節激酶（ERK）的磷酸化水平下降，而β-HB-regorafenib聯合處理顯著降低B-raf、MEK和ERK的活化（圖5C、D）。Annexin V/PI染色顯示，β-HB處理不影響Huh7-SR和Sk-Hep-1- SR細胞的早期和晚期凋亡率（圖5E）。此外，在β-HB和瑞戈非尼共處理的SR細胞中，凋亡率并沒有增加（圖5F）。這些結果表明，β-HB處理通過抑制B-raf/MAPK通路而不是促進凋亡來增強HCC-SR細胞的藥物敏感性。

圖5. β-HB通過抑制B-raf/MAPK通路逆轉Huh7-SR和Sk-Hep-1-SR細胞對索拉非尼的耐藥并增強瑞戈非尼的敏感性

5. β-HB通過抑制HCC-SR細胞的遷移能力和EMT，提高瑞戈非尼的細胞毒性作用

       單獨使用瑞戈非尼僅輕微抑制HCC-SR細胞的遷移，而聯合使用β-HB顯著抑制Huh7-SR和SkHep-1-SR細胞的遷移（圖6A-D）。EMT相關分子分析顯示，上皮相關標志物β-catenin和zona occludens（ZO）-1的表達在β-HB和瑞戈非尼聯合處理的HCC-SR細胞和瑞戈非尼單獨處理的HCC-SR細胞之間沒有差異（圖6E，F）。然而，間質標志物vimentin和N-cadherin的表達在β-HB和瑞戈非尼聯合處理的細胞中降低（圖6E，F）。這些結果表明，β-HB處理通過調節EMT介導的肝癌細胞-SR的遷移能力來增強瑞戈非尼的敏感性。

圖6. β-HB通過抑制Huh7-SR和Sk-Hep-1-SR細胞的N-cadherin/vimentin軸而增強瑞戈非尼的抗遷移作用

6. β-HB治療可下調體內HCC-SR的增殖和代謝蛋白表達

       裸鼠移植瘤模型檢測β-HB是否抑制索拉非尼耐藥腫瘤的生長。將皮下種植Sk-Hep-1-SR細胞的NOD/SCID小鼠分為3組：溶劑對照組、β-HB（300 mg/kg）處理組和β-HB（600 mg/kg）處理組。研究期間雖然β-HB治療對腫瘤的大小和重量沒有負面影響（圖7B，C），但增殖細胞核抗原（PCNA）的蛋白水平在β-HB治療的SR腫瘤中顯著降低（圖7D，E），這意味著β-HB具有抗增殖作用。此外，β-HB處理降低LDHA蛋白水平，增加PDH水平（圖7D，E）。相反，FAS蛋白表達模式在三組中相似（圖7D，E）。這些數據表明，β-HB處理通過改變糖酵解和乳酸信號通路損害HCC-SR細胞的增殖。

圖7. β-HB降低荷瘤小鼠PCNA和LDHA的表達，增加PDH的表達

結論

       綜上所述，本研究發現外源性β-HB可通過誘導糖酵解轉移減少乳酸生成，逆轉索拉非尼耐藥；它還與瑞戈非尼協同治療索拉非尼耐藥的HCC。

實驗方法

細胞培養，索拉非尼耐藥細胞的產生，細胞活力測定，WB，傷口愈合遷移試驗，β-HB量化，乙酰乙酸鹽量化，乳酸量化，游離脂肪酸定量，RNA提取和逆轉錄定量聚合酶鏈反應，免疫組化，IPA，細胞凋亡檢測

參考文獻

Suk FM, Wu CY, Fang CC, Chen TL, Liao YJ. β-HB treatment reverses sorafenib resistance by shifting glycolysis-lactate metabolism in HCC. Biomed Pharmacother. 2023 Oct;166:115293. doi: 10.1016/j.biopha.2023.115293. Epub 2023 Aug 9. PMID: 37567069.