MAF擴增增加乳腺癌（BCa）轉移的風險，其機制尚不清楚，但具有重要的臨床意義。雌激素受體陽性（ER+） BCa的生長和轉移都需要雌激素，盡管其機制尚不清楚。在這里，作者整合了蛋白質組學、轉錄組學、表觀基因組學、染色質可及性和人類和同基因小鼠BCa模型的功能分析，表明MAF直接與雌激素受體α （ERα）相互作用，從而促進了一種獨特的染色質景觀，有利于轉移擴散。作者確定了在雌激素暴露后以MAF依賴方式重新許可的促進轉移的基因。組蛋白去甲基化酶KDM1A是表觀基因組重塑的關鍵，它促進了促轉移性MAF/雌激素驅動基因表達程序的表達，而KDM1A活性的喪失阻止了這種轉移。因此，作者已經確定MAF/雌激素介導的轉移的分子基礎需要來自全身環境的遺傳、表觀遺傳和激素信號，這些信號影響BCa細胞轉移的能力。本文于2023年11月發表于《Nature Cell Biology》, IF: 21.3，Q1。

技術路線：

主要實驗結果：

1、MAF過表達促進ER+BCa細胞骨轉移

        為了分析MAF在ER+BCa中的作用，作者首先分析了ER+BoM2 BCa細胞，這些細胞是從親本ER+MCF7 BCa細胞群中選擇的小鼠骨趨向性細胞，因為它們在體內驅動轉移的能力。值得注意的是，MCF7細胞可能有局限性，但與其他腔內BCa細胞（如T47D和ZR-75）相比，不存在內質網和雄激素受體活性之間的混淆相互作用。在體內，MAF過表達足以顯著增加MCF7細胞接種于胸腺裸鼠左心室時的骨轉移率，而在其他部位無轉移差異（圖1b、c）。體內腫瘤生長需要補充雌激素。接下來，作者測試了MAF過表達是否以E2依賴的方式增強體外細胞增殖。與模擬E2處理的細胞或激素剝奪（HD）對照相比，MAF陽性細胞中E2刺激的細胞增殖增強，表明MAF表達與E2之間存在生物學相互作用。

        接下來，作者建立了一個條件Maf過表達敲入小鼠模型（Rosa26LSLMAF），以:（1）提供一種獨立的方法，（2）排除人BCa細胞系中獲得性遺傳改變的存在，（3）直接測試MAF表達增加對E2依賴性BCa轉移的影響。為了誘導小鼠BCa腫瘤，作者用醋酸甲孕酮和7,12-二甲基苯并蒽（MPA-DMBA）處理Rosa26LSLMAF小鼠，使用已建立的BCa化學致癌方案（圖1d,e）。作者在體外擴增小鼠腫瘤源性細胞系（mTB細胞）;值得注意的是，這些保留了內質網和角蛋白的表達（圖1f,g）。然后用Ad-Cre顆粒感染誘導Maf（或不誘導，作為對照），作者得到了具有相同基因組背景的等基因細胞系對，無論是否有Maf過表達（圖1d,h,i）。無論注射部位如何，Maf陽性的mTB細胞比Maf陰性的對照mTB細胞產生更多的骨轉移（圖1j,k）。最后，作者證實Maf誘導的骨轉移對雙磷酸鹽治療是不耐受的，并且骨外轉移（肺、肝、腎、卵巢和腦）顯著促進，如患者所述（圖1l,m）。

        總的來說，這些結果證實了MAF -陽性細胞在骨定植過程中具有競爭優勢，可以被MAF -陰性細胞所吸收，產生以MAF -陽性克隆為主的異質性轉移。因此，作者接下來重點闡明（1）E2信號與ER+BCa細胞中MAF -過表達之間相互作用的分子機制，以及（2）這些相互作用如何促進骨轉移。

MAF擴增驅動E2/ER信號依賴性BCa轉移

2、MAF、ER和染色質因子在ER+BCa細胞中相互作用

        MAF編碼AP1家族轉錄因子（TF），其DNA結合（因此其促轉移活性）可能取決于與細胞環境特異性表達的相互作用伙伴。為了以無偏倚的方式鑒定活BCa細胞中與MAF相互作用的蛋白質，作者進行了鄰近依賴的生物素鑒定（BioID2），可以檢測到微弱和短暫的相互作用。雖然在功能上沒有區別，但作者同時使用了短（MAF-S）和長（MAF-L）亞型，以避免任何潛在的亞型依賴偏差。每個MAF異構體在框架內融合到BioID2的N或C端，分別產生MAF-BioID2- HA和myc-BioID2-MAF（圖2a）。從含有BioID2- MAF或（作為對照）BioID2的生物素處理細胞中提取鏈霉親和素后，通過串聯質譜（nanoLC-MS/MS）鑒定共沉淀蛋白。作者獲得了許多高置信度的交互作用因子（方法）:139 N -末端標記的MAF-S，119 C -末端標記的MAF-S，174 N -末端標記的MAF-L,154 C -末端標記的MAF-L（圖2a）。然后，作者選擇了92個MAF-S條件共有的相互作用因子，以及105個MAF- L條件共有的相互作用因子，來定義一個126個MAF高置信度相互作用因子的網絡（其中71個在所有四種條件下都是常見的）。這組126個基因中包括表征良好的MAF相互作用因子CREBBP，并且在已知蛋白質-蛋白質相互作用的高度互聯網絡中被強烈富集（P < 1 × 10?16），表明MAF相互作用因子之間存在生物相關復合物（圖2b）。事實上，存在一些主要的染色質重塑復合物，如SWI/SNF、INO80、NurD和CoREST。GO富集分析還確定了影響基因表達的分子功能，包括激素受體信號家族的成員。值得注意的是，ER本身作為生物學相關的MAF相互作用物出現（圖2a-c）。內質網和其他相互作用因子隨后通過共免疫沉淀（co-IP;圖2d）進行驗證。為了確定ER的存在是否會影響MAF的相互作用，使用ER- MDA-MB-231 BCa細胞進行BioID（圖2c）。在這些ER-細胞中，MAF保留了與SWI/SNF、INO80、NurD和CoREST染色質重塑復合物的某些組分的相互作用，但不與ER和/或關鍵ER共激活子相互作用（圖2c）。總的來說，這些數據表明MAF和特定伙伴之間的相互作用依賴于細胞類型。

MAF與內質網轉錄復合物相互作用

3、MAF的N端轉激活結構域與ER相互作用

        接下來，作者使用HA標記的MAF- S和MAF- L在MCF7細胞中通過co-IP驗證MAF的相互作用（圖2d）。通過近距離連接試驗（PLAs），作者證實了MAF-ER相互作用和共定位，與單一抗體對照相比，HA和ER抗體聯合在細胞核中檢測到和量化的熒光信號明顯更高（圖2e,f）。基于在MCF7 ER+BCa細胞中使用ER特異性PROTAC誘導ER降解，作者證實了MAF-ER相互作用的特異性（圖2e-g）。然后，作者使用PLA通過比較全長MAF- L與缺少部分或全部轉錄激活域的截斷版本（分別為ΔN-t 1, aa 85-403和ΔN-t 2, aa 120-403）來研究與ER相互作用的MAF的蛋白質結構域。然而，作者不能排除與ER AF1或AF2結構域的相互作用具有不同的作用，如前所述。

4、MAF-ER相互作用導致轉錄重編程

        接下來，作者對激素剝奪（HD）或E2處理6小時的MCF7細胞進行RNA測序（RNA-seq）（圖3a,b）。作者確定了轉錄變化需要（1）MAF過表達（簇1和2），（2）E2（簇3和4）和（3）MAF和E2（這里，MAF/E2依賴;簇5和6）（圖3a）。與E2刺激的增殖一致，E2處理與E2早期和晚期基因應答（簇3）正相關（圖3a,b），包括已建立的ER介導的應答基因GREB1, CCND1和PGR（圖3c）。值得注意的是，MAF/E2依賴性基因標記（簇5）與E2早期和晚期反應、炎癥和上皮向間質轉化（EMT）基因反應呈正相關，包括PTHLH、JAG1、FGF18、TMEM2、TGFA、JAK1和SHH;這些基因產物支持轉移適應能力，尤其是骨（圖3d,e）。重要的是，作者觀察到在ER+BCa患者基因表達數據集中，包括乳腺癌國際分子分類協會（METABRIC）和癌癥基因組圖譜（TCGA） BCa隊列中，MAF的表達水平與FGF18、PTHLH、JAG1、TMEM2、TGFA、JAK1和SHH的表達水平呈正相關（圖3f）。總的來說，這些數據表明MAF過表達在E2刺激下以ER依賴的方式擴大了ER+BCa細胞的轉錄庫。作者提出MAF過表達支持BCa在增殖和原發腫瘤生長之外的進展，可能是通過直接激活骨微環境使其更容易接受轉移狀態。

MAF調節E2/ ER誘導的轉移轉錄基因程序

5、MAF在染色質上重新分配內質網以靶向轉移相關基因

        為了深入了解MAF的全基因組定位，并評估其在E2處理后與ERα的潛在直接相互作用，作者在對照和MAF過表達的MCF7 BCa細胞中進行了ERα和MAF染色質免疫沉淀和高通量測序（染色質免疫沉淀和測序，ChIP-seq）。事實上，只有在E2處理后，才觀察到ER與染色質的廣泛結合，這表明E2在內質網向染色質募集中的作用（圖4a）。相反，MAF的結合在很大程度上獨立于E2（圖4a）。然而，有趣的是，在E2的作用下，ER和MAF都結合了一組共享的基因組位點（576），其中一些位點（196）僅在MAF過表達的細胞中被ER結合（圖4a,b）。在基因組瀏覽器中對這些位點進行目視檢查，發現E2誘導的MAF-E2依賴性ER與MAF-E2靶轉移支持基因相關增強子中的未知靶點結合，如FGF18、PTHLH、JAG1、TMEM2、TGFA、JAK1和SHH（圖4c；注意GREB1、CCND1和PGR被用作真正的ER/E2靶點）。這些假定的順式調控元件在MAF共識結合基序（MARE和MAF）中富集，并且與增強子標記p300的ChIP-seq峰相吻合（圖4d）。

        接下來，作者使用CRISPR干擾（CRISPRi）來抑制PTHLH和JAGGED1轉錄起始位點（TSSs）附近的這些假定的MAF應答元件，以確認它們的功能作用。在使用特定的單導RNA （sgRNA）對共享的MAF/ER峰位點和dCas9失活后，MAF/ER依賴的轉錄對PTHLH和JAGGED1的轉錄誘導顯著減弱，與E2無關（圖4e）。總的來說，作者的數據表明MAF的存在直接或間接地增加了ER與染色質的結合。此外，MAF直接與ERα相互作用，因此其在BCa中的過表達與ER順反組相關聯并擴大（圖4f）。作者假設MAF過表達，通過其與染色質重塑物的直接相互作用（圖2c），啟動染色質引物，響應E2，促進ER基因調控，最終促進ER+BCa的轉移過程。

MAF染色質結合與內質網重疊并擴展其結合

6、ER/MAF協同提供了一個特定的染色質景觀

        接下來，作者在E2刺激下生成了高度轉移的MAF陽性MCF7 BCa細胞的染色質可及性圖。與對照細胞相比，MAF過表達和E2刺激都在細胞染色質狀態上留下了明顯的印記，這是通過染色質可及性的變化來測量的;作者可以定義MAF依賴簇A和B（分別為97和80個峰），E2依賴簇C和D（分別為40和76個峰）以及MAF/E2依賴簇E和F（分別為621和797個峰）（圖5a-c）。MAF/E2依賴性簇特有的廣泛染色質重塑在ER耗盡時丟失，主要是在帶注釋的啟動子/ TSSs（圖5d）。重要的是，與其他簇相比，MAF依賴簇A和E的啟動子/TSS區域的ATAC（轉座酶可及染色質測定）峰的寬度顯著增加（圖5e）。值得注意的是，MAF依賴的ATAC峰與BCa細胞中的組蛋白標記重疊，并與啟動子區域的轉錄激活（H3K27Ac, H3K4me3）相關（圖5f）。

        為了確定這些鑒定出的染色質可及性峰的變化是否反映了觀察到的轉錄變化（圖3a），作者整合了ATAC-seq和RNA-seq數據集。MAF過表達E2處理細胞的ATAC-seq數據顯示，MAF和E2同時調控表達的基因顯著富集（圖5g;集群A至F如圖5a所示）。

MAF擴增引起染色質景觀的變化

7、MAF和ER調控轉移基因表達程序

        為了將這些染色質結合事件與轉錄調控聯系起來，作者使用先前描述的RNA-seq數據進一步表征了MAF/E2依賴性基因（圖3a）。GO分析顯示，E2上調的一些基因是已知的雌激素反應基因（如ple、MYC和細胞周期介質）。其他MAF/E2依賴基因屬于以前未與E2信號相關的途徑（圖3b,d），包括與侵襲性和高度轉移性BCa表型相關的基因（例如，EMT，炎癥）。重要的是，MAF和ER之間共享的染色質結合位點是最近發現的E2靶向基因附近最富集的位點，以及經典的E2應答（圖6a）。同樣，在MAF/E2條件下，差異開放和關閉的染色質區域在ER ChIP峰中富集（開放峰363個，關閉峰193個）（圖6b）。總的來說，這些數據表明，在本文發現的E2靶基因附近以前未被發現的順式調控元件可能被MAF用于支持ERα結合并激活轉錄。

        根據多個TCGA患者腫瘤中500 kb范圍內RNA-seq和ATAC-seq信號的相關性，作者可以推斷患者樣本中MAF-ER結合直接控制的靶基因（而不僅僅依賴于基因接近性）。重要的是，作者發現，在MCF7細胞中同時被ER和MAF占據的患者乳腺腫瘤中，ATAC-seq峰通過啟動子-增強子連接在功能上與E2靶基因表達的控制相關聯，其程度高于偶然預期（例如，SOX9與近似隨機排列相比，P < 0.0001;圖6 c, d）。相比之下，單獨由MAF結合的位點沒有顯示出這種實質性的富集（圖6c）。總的來說，這些結果表明E2主要通過ER位點發出信號，然而，在MAF表達時，ER能夠與MAF一起結合到以前未被發現的基因組位點，從而從經典的E2應答基因程序中擴展E2誘導的轉錄庫。事實上，通過整合RNA-seq轉錄組學和MAF-和MAF/E2依賴性ER ChIP-seq數據產生的MAF-依賴性基因標記確定了ER+患者的一個子集，其最初經歷骨骼復發的可能性更高（圖6e）。

共享ER-MAF結合位點控制E2誘導的轉移基因程序

8、定義ER BCa轉移的表觀遺傳開關

        接下來，作者將重點放在高可信度的MAF相互作用物上，這些相互作用物可能通過組蛋白甲基化與MAF介導的全局染色質打開有關，并且以前與癌癥有關。KDM1A在貝葉斯錯誤發現率（BFDR） < 0.001的相互作用組中進行了顯著性分析（圖2c），它編碼一種黃素依賴的單胺氧化酶，可以去甲基化單和二甲基化賴氨酸（K），特別是組蛋白3和賴氨酸4和賴氨酸9 （H3K4和H3K9）。值得注意的是，高KDM1A活性存在于許多癌癥類型中，包括BCa。為了確定在MAF過表達的情況下，抑制KDM1A活性對E2介導的轉錄重布線的影響，作者在MCF7 BCa細胞中進行了PLA測定和KDM1A和MAF的co-IP（圖7a）。與對照細胞相比，KDM1A敲除的細胞PLA信號明顯減少（具有短針亂置（shSc））（圖7a-c）。這些結果證實了MAF直接與KDM1A結合，并表明這種相互作用有助于促進MAF - ER相互作用。

        為了分析KDM1A敲低是否會影響MAF/ E2介導的基因應答，作者比較了HD與E2處理細胞的RNA-seq數據（圖3a中簇5和6）（圖7d）。在MAF過表達的細胞中，作者觀察到缺乏KDM1A活性降低了E2/ ER誘導和MAF依賴性基因的表達（例如，FGF18, PTHLH, SOX9, TMEM2, JAK1和SHH）（圖7d,e），但其他基因沒有（圖7d,e）。綜上所述，這些結果表明KDM1A有助于MAF依賴性基因反應，包括MAF/ E2依賴性基因反應的一個子集。

KDM1A抑制破壞E2/ER和MAF依賴的信號傳導并阻止轉移

9、KDM1A阻斷可拮抗MAF依賴性轉移

        接下來，作者測試了KDM1A的高選擇性共價抑制劑iaddemstat （ORY -1001）是否可以阻斷MAF介導的轉移。經ORY-1001處理后，MCF7和mTB細胞顯示H3K9me2積累，顯示KDM1A去甲基化酶活性的功能性抑制（圖7f,g）。為了測試KDM1A抑制是否會阻止表達MAF的BCa細胞形成骨轉移，作者使用了體外骨培養陣列（BICA）。然后，作者將對照或表達Maf -的mTB細胞接種到免疫無能力的同基因小鼠（FVB背景）的脛骨中。值得注意的是，ORY -1001治療顯示骨病變的數量和大小均顯著減少，但僅在表達Maf的組（圖7i），這表明KDM1A介導的Maf表達細胞的表觀遺傳變化驅動了骨適應和轉移。

結論：

        作者報告了一種以前未知的MAF-ER相互作用，這種相互作用是由表觀基因組機制驅動的，并有助于BCa臨床相關的轉移結果。這涉及MAF驅動的染色質擾動，大大擴展了ER轉錄范圍，超出了目前描述的目標。總的來說，作者的研究結果支持E2存在下MAF擴增后ER+BCa骨轉移增強。重要的是，作者證明了在ER+腫瘤中，MAF的擴增和過表達將典型細胞重新編程，使其包含以前未知的增強子和轉錄活性，從而促進骨轉移。該程序重定向DNA可及性，并通過KDM1A介導的轉錄通道促進轉移。這些數據表明，染色質失調是BCa轉移的早期事件，而基因組擴增在這一過程中起著核心作用。作者的結果為探索KDM1A在這種臨床背景下的抑制作用打開了大門。

實驗方法：

        Maf轉基因小鼠的產生；Southern blot；長PCR分析；細胞培養；小鼠Bca誘導腫瘤及衍生細胞外植體；MAF過表達細胞的產生；慢病毒加工；鄰近依賴生物素鑒定（BioID）；網絡分析；Dot-plot分析；BioID相互作用富集分析；免疫印跡法；免疫熒光；免疫共沉淀；聚乳酸實驗；PROTAC用于目標降解；RNA-seq；預處理和差異表達分析；內質網降解的RNA-seq；RNA-seq（與敲除KDM1A后的樣品比較）；逆轉錄定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）；患者隊列的相關性和生存數據分析；體外BrdU摻入測定；組織病理學和免疫治化學；細胞增殖試驗及半最大抑制濃度（IC50）測定；ATAC-seq；內質網降解的ATAC-seq；ATAC-seq和RNA-seq數據的整合；ER和MAF ChIP-seq；H3K27Ac和H3K4me3 ChIP-seq；ChIP-seq和RNA-seq數據的整合；超增強子的識別和分配；CRISPRi；循環腫瘤細胞；細胞競爭試驗；BICA。

參考文獻：

        Llorente A, Blasco MT, Espuny I, Guiu M, Ballaré C, Blanco E, Caballé A, Bellmunt A, Salvador F, Morales A, Nu?ez M, Loren G, Imbastari F, Fidalgo M, Figueras-Puig C, Gibler P, Graupera M, Monteiro F, Riera A, Holen I, Avgustinova A, Di Croce L, Gomis RR. MAF amplification licenses ERα through epigenetic remodelling to drive breast cancer metastasis. Nat Cell Biol. 2023 Nov 9. doi: 10.1038/s41556-023-01281-y. Epub ahead of print. PMID: 37945904.