三陰性乳腺癌(TNBC)是一種侵襲性疾病，其特征是顯著的腫瘤內異質性(ITH)，這給治療帶來了挑戰。然而，TNBC中ITH的臨床相關性和關鍵決定因素尚不清楚。在這里，作者使用多組學數據在作者中心的隊列(n=260)、癌癥基因組圖譜隊列(n=134)和四個免疫治療隊列(n=109)中全面表征ITH水平。作者的研究結果顯示，高ITH與患者生存差和免疫治療抵抗有關。重要的是，作者發現鋅指蛋白689 (ZNF689)缺乏是ITH形成的關鍵決定因素。ZNF689-TRIM28復合物被發現直接結合到長穿插元件-1 (LINE-1)的啟動子上，誘導H3K9ME3介導的轉錄沉默。ZNF689缺陷重新激活了LINE-1逆轉錄轉位，加劇了基因組的不穩定性，從而促進了ITH。單細胞RNA測序、空間轉錄組學和流式細胞術分析證實，ZNF689缺陷誘導的ITH抑制抗原呈遞和T細胞活化，賦予免疫治療抗性。藥物抑制LINE-1可顯著降低ITH，增強抗腫瘤免疫，最終使體內缺乏ZNF689的腫瘤對免疫治療增敏。在臨床樣本中，ZNF689的表達與良好的預后和免疫治療反應呈正相關。總之，作者的研究揭示了ZNF689缺陷誘導ITH的機制，并建議LINE-1抑制聯合免疫治療作為TNBC的一種新的治療策略。該文章于2024年1月發表在《Cell research》，IF：44.1。

技術路線：

技術路線圖

主要研究結果：

1. 在TNBC中，高ITH降低了患者的生存率，并賦予了免疫治療耐藥性

         作者利用本中心隊列(FUSCC隊列，n = 260)和TCGA隊列(n = 134)的多組學數據，全面表征TNBC的ITH，包括全外顯子組測序(WES)結果、體細胞拷貝數變異(SCNV)數據、轉錄組RNA測序(RNA-seq)數據、H&E圖像和臨床數據(圖1a)。為了推斷遺傳ITH，作者使用PyClone來估計每個腫瘤的亞克隆數量。為了研究ITH在TNBC中的臨床相關性，作者進行了Kaplan-Meier生存分析。作者的研究結果表明，遺傳或組織學ITH的增加與FUSCC隊列中較低的總生存期(OS)、無復發生存期(RFS)和遠端無轉移生存期(DMFS)相關(圖1b， c)。為了確定TNBC中ITH的下游通路，作者分析了FUSCC隊列的轉錄組差異?；蚣患治?span>(GSEA)結果顯示，高遺傳ITH與典型免疫特征(如IFN應答和IL-6、JAK和STAT3途徑)呈反相關(圖1d)。此外，高ITH與CD8評分、腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)評分和細胞溶解(CYT)評分呈負相關(圖1e)，表明高ITH可能導致免疫排斥腫瘤。以往的研究表明，ITH對免疫治療的療效有重大影響。因此，作者在四項基于抗pd -1的TNBC臨床試驗(n = 109)中探討了ITH(通過H&E切片衍生的組織學ITH進行評估)對抗腫瘤免疫反應的影響(圖1f)。新輔助試驗NCT04613674和NCT04418154分別包括29例和16例患者的H&E圖像，分析結果顯示，高ITH腫瘤的病理完全緩解(pCR)率顯著降低(圖1g， h)。在第三個隊列(NCT03805399)中，作者檢查了29例患者的H&E圖像，觀察到高ITH腫瘤的ORR較低(圖1i)。在最后一個隊列(NCT04129996)中，作者評估了35例患者的H&E圖像，發現高ITH腫瘤患者的ORR較低，無進展生存期(PFS)和OS較短(圖1j)?？偟膩碚f，作者的研究結果表明，高ITH降低了TNBC患者的生存率，并賦予了免疫治療耐藥性。

圖1 高ITH降低了TNBC患者的生存率，并導致免疫治療抵抗

2. 缺乏ZNF689可促進TNBC的ITH

         為了探索TNBC中ITH的關鍵決定因素，作者使用隊列數據分析了拷貝數改變、體細胞突變和轉錄組。由于高遺傳ITH或組織學ITH腫瘤表現出與低ITH腫瘤相似的SCNVs和突變景觀，作者專注于轉錄組學分析。分別在遺傳水平和組織學水平上獲得高ITH組和低ITH組的差異表達基因后，作者發現共有6個差異表達基因(MUC19、PGC、DHRS2、ZNF689、TDRD12和C20orf114)(圖2a)。接下來，作者設計實驗確定了誘導TNBC ITH的最關鍵基因(圖2b)。LM2球體的h&e染色圖像顯示，使用短發夾RNA (shRNAs)敲除ZNF689顯著增加組織學ITH(圖2c， d)。具體來說，與低ITH組相比，高遺傳和組織學ITH組ZNF689的平均表達分別降低了3倍和2.6倍。綜上所述，這些發現表明ZNF689可能是TNBC中ITH調節的關鍵因素，需要更深入的實驗探索。

         為了研究ZNF689是否能在體內影響TNBC ITH，作者設計了一系列實驗，使用免疫缺陷和免疫正常的小鼠(圖2e)。(1)作者選擇了一個TNBC患者來源的異種移植(PDX)標本，該標本具有低遺傳ITH(由兩個亞克隆證明)和低組織學ITH，同時ZNF689表達升高。在該PDX模型建立后，作者進行了針對ZNF689的siRNA瘤內注射。值得注意的是，ZNF689的缺失顯著增加了遺傳ITH和組織學ITH水平(圖2f)。用siZNF689處理的PDX腫瘤也顯示出比對照組更快的生長速度。(2)將穩定表達shNC和shZNF689的LM2細胞皮下注射到NOD/SCID小鼠的乳腺脂肪墊(mfp)中。作者發現ZNF689敲低顯著增加免疫缺陷小鼠異種移植物的遺傳和組織學ITH水平(圖2g)。(3)將穩定表達載體和ZNF689的LM2細胞皮下注射到NOD/SCID小鼠的mfp中。作者觀察到ZNF689過表達限制了LM2腫瘤異種移植物的遺傳ITH和組織學ITH(圖2h)。 (4)將過表達ZNF689或ZNF689的4T1細胞皮下注射到BALB/c小鼠的mfp中。作者發現ZNF689缺失導致4T1同基因移植物的組織學ITH顯著升高(圖2i)。相比之下，ZNF689過表達導致組織學ITH程度較低(圖2j)。綜上所述，這些結果表明，ZNF689缺乏在體內和體外都能促進TNBC中的ITH。

圖2 ZNF689缺失促進TNBC中ITH

3. ZNF689通過TRIM28復合體抑制LINE-1逆轉錄

         為了分析ZNF689缺乏如何促進TNBC中ITH的潛在機制，作者應用基于細胞培養(SILAC)的氨基酸穩定同位素標記定量蛋白質組學來篩選ZNF689相互作用蛋白。作者選擇了排名最高的蛋白TRIM28進行進一步的結合驗證。TRIM28是kr<s:1> pel-associated box domain zinc finger protein (KRAB-ZFP)轉錄因子的通用輔因子。內源性ZNF689和TRIM28的共免疫沉淀(co-IP)實驗以及western blotting表明，這兩種蛋白可以在LM2、Hs578T和HEK293T細胞中以內源性水平相互作用(圖3a)。利用重組ZNF689和TRIM28蛋白進行的體外下拉實驗進一步表明，這種相互作用可能是直接的(圖3b)。

圖3 ZNF689通過TRIM28復合體介導的轉錄沉默抑制LINE-1逆轉錄轉位

         KRAB-ZNFs的主要作用是通過招募轉錄調節因子TRIM28和組蛋白H3 Lys9三甲基化(H3K9me3)依賴性異染色質形成和DNA甲基化的相關介質來沉默重復元件(REs)。由于REs是遺傳變異和基因組進化的主要參與者，作者推測ZNF689可能通過調控REs抑制TNBC ITH。為了研究是否有任何已知的REs受到ZNF689缺失的調控，作者對siNC-和siZNF689處理的LM2細胞進行了RNA測序。使用RepEnrich軟件對數據進行分析，量化RE表達。GSEA還顯示，在siZNF689處理的細胞中，人LINE-1基因標記顯著上調(圖3c)。為了驗證轉錄組學分析，作者進行了實時定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)和western blotting來定量LINE-1。作者觀察到，ZNF689缺陷顯著上調了人(LM2和Hs578T)和鼠(4T1和AT3) TNBC細胞系中LINE-1 mRNA及其編碼蛋白ORF1p和ORF2p(圖3d)。為了檢查在沒有ZNF689的情況下LINE-1的逆轉錄轉位活性是否會增加，作者使用工程的LINE-1報告系統對ZNF689敲除細胞(MDA-MB-231和Hs578T)進行了逆轉錄轉位分析(圖3f)。值得注意的是，在敲除ZNF689的細胞中，LINE-1的反轉錄頻率高于對照細胞(圖3g)。作者還通過RT-qPCR檢測到在ZNF689敲除的人和鼠TNBC細胞系中LINE-1的基因組DNA含量升高(圖3h)。LINE-1的轉錄是由LINE-1 5 '-非翻譯區(UTR)的內部啟動子驅動的為了驗證ZNF689是否直接調控LINE-1的轉錄，作者將人LINE-1的5′-UTR克隆到熒光素酶報告質粒中。ZNF689過表達強烈抑制Hs578T和HEK293T細胞的熒光素酶活性(圖3i)。使用測序(ATAC-seq)對轉座酶可接近的染色質進行分析，支持了ZNF689缺陷導致全長LINE-1啟動子的抑制和染色質可接近性增加的觀點(圖3j)。

         TRIM28作為沉默復合體的支架，沉默復合體包括組蛋白甲基轉移酶SETDB1、核小體重塑和去乙?；?span>(NuRD)復合體、異染色質蛋白1 (HP1)和DNA甲基轉移酶通過聯合ip分析，作者鑒定出SETDB1、DNMT3B、HP1α、HP1γ和SUV39H1是額外的ZNF689相互作用蛋白。LINE-1的啟動子選擇性富集于組蛋白變體H3.3和組蛋白標記H3K9me3中，這對維持LINE-1.30的抑制狀態至關重要。因此，作者假設ZNF689可能將這些酶招募到LINE-1啟動子中，以增強H3K9me3介導的轉錄沉默。ChIP-seq分析顯示，ZNF689基因敲低后，全長LINE-1啟動子上的H3K9me3修飾減少(圖3k)。隨后的分析顯示，在缺乏ZNF689的情況下，TRIM28在該位點的募集減弱(圖31)。這些數據支持ZNF689和TRIM28協同結合介導LINE-1啟動子上的H3K9me3修飾(圖3m)。綜上所述，這些結果表明ZNF689通過TRIM28復合體介導的轉錄沉默抑制LINE-1逆轉錄轉位(圖3n)。

4. ZNF689缺陷誘導的LINE-1逆轉錄轉位加劇了基因組不穩定性并促進ITH

圖4 ZNF689缺陷誘導的LINE-1逆轉錄轉位加劇了基因組不穩定性并促進ITH

         LINE-1逆轉錄轉位是基因組不穩定性的主要來源，表現為雙鏈DNA斷裂增加和染色體不穩定性(CIN)。因此，作者假設ZNF689缺陷可能通過抑制LINE-1逆轉錄轉位來促進ITH，從而導致基因組不穩定性增加。首先，作者檢測了磷酸化組蛋白H2AX (γH2AX)，這是一種用于評估基因組不穩定性的DNA雙鏈斷裂標記IF檢測(圖4a)顯示，ZNF689敲低可增強γ - h2ax水平，這與ZNF689敲低原位LM2腫瘤的結果一致(圖4b)。接下來，作者探討了ZNF689缺乏在CIN中的潛在作用。中期染色體擴散試驗顯示，ZNF689敲低細胞中染色體畸變明顯增加(圖4c)。H&E切片的組織學檢查也證實了ZNF689缺陷與后期染色體錯分離增加之間的顯著相關性(圖4d)。這些結果表明，ZNF689缺陷導致TNBC基因組不穩定性增加。

         逆轉錄酶抑制劑如EFV可以有效阻斷內源性逆轉錄酶的酶活性，被認為是LINE-1逆轉錄轉位的潛在特異性抑制劑。作者觀察到EFV有效地減輕了ZNF689敲低誘導的LINE-1反轉錄轉位和基因組DNA含量改變(圖4e)。隨后的IF測試(圖4f)顯示，EFV處理減弱了ZNF689敲低誘導的γ - h2ax上調。EFV還減少了ZNF689缺失細胞的染色體畸變(圖4g)。這些結果表明，ZNF689缺陷通過LINE-1逆轉錄轉位加劇了基因組的不穩定性。接下來，作者在體內研究了ZNF689缺陷誘導的ITH是否可以通過抑制LINE-1逆轉錄轉位來逆轉。作者用shNC或shZNF689 LM2細胞構建MFP異種移植模型。1周后，NOD/SCID小鼠隨機分組，每天給藥(Veh)對照或腹腔注射EFV (圖4h)。值得注意的是，EFV顯著降低了ZNF689缺失腫瘤的遺傳ITH(圖4i)和組織學ITH(圖4j)，這表明ZNF689缺失的ITH促進作用依賴于LINE-1逆轉錄轉位。原位腫瘤免疫組化(IHC)分析顯示，EFV可有效降低ZNF689缺陷腫瘤中γ - h2ax陽性區域(圖4k)。此外，EFV顯著下調了ZNF689缺陷腫瘤中LINE-1的DNA含量(圖41)。總之，結果支持ZNF689缺陷通過抑制LINE-1逆轉錄轉位加劇基因組不穩定性以促進ITH(圖4m)。

5.ZNF689缺陷誘導的高ITH損害抗原呈遞和T細胞活化

         作者發現，高ITH賦予TNBC免疫治療耐藥性(圖1f-j)。為了直接評估ITH誘導下的腫瘤微環境重塑，作者進行了單細胞RNA測序(scRNA-seq)來表征shZNF689或shNC 4T1同基因移植物收獲的細胞轉錄組的變化(圖5a)。最后，作者從shZNF689組收集了10，913個細胞，從shNC組收集了14，788個細胞。整合所有獲得的細胞的轉錄組學數據后，統一流形近似和投影(UMAP)可視化顯示了六種細胞類型，包括癌細胞、骨髓細胞、B細胞、T細胞、癌癥相關成纖維細胞(CAFs)和內皮細胞。值得注意的是，T細胞在ZNF689缺陷腫瘤細胞中的比例下降(補充信息，圖S8d)。為了準確地定義T細胞，作者將T細胞分為7個亞型:活化的CD8+ T細胞、調節性T細胞(Treg)、Tcf7+ T細胞、效應T細胞(Teff)、增殖T細胞(Tpro)、Isg+ T細胞和CD4+ na?ve T細胞(圖5b)。ZNF689缺陷組活化的CD8+ T細胞、Teff、Tpro和Isg+ T細胞減少，而Tregs、Tcf7+ T細胞和CD4+ na?ve T細胞增加(圖5c)。這一發現也通過BALB/c小鼠4T1腫瘤免疫細胞譜的流式細胞分析得到了驗證，其中ZNF689敲除降低了腫瘤CD4+ T細胞浸潤、CD8+ T細胞浸潤以及顆粒酶B+ (GZMB+)和IFN-γ+ CD8+ T細胞的百分比(圖5d)。同樣，scRNA-seq數據顯示，ZNF689缺陷腫瘤中的T細胞表達細胞毒性T細胞標志物(Ifng、Nkg7、Prf1和Gzmb)水平降低，但抑制性T細胞標志物(Ctla4和Btla)和Treg標志物(Foxp3、II2ra和Ikzf3)水平升高(圖5e)。

圖5 ZNF689缺陷誘導的ITH損害抗原呈遞和T細胞活化

         接下來，作者研究了ZNF689缺陷誘導的ITH調控T細胞介導的抗腫瘤免疫的詳細機制。來自scRNA-seq的T細胞和癌細胞通路分析顯示，在ZNF689缺陷組中，IFN反應和抗原加工和遞呈(APP)下調(圖5f， g)。Bulk RNA-seq證實，在siZNF689處理的LM2細胞和高ITH腫瘤中，APP通路明顯缺失(圖5h)。為了揭示ZNF689缺陷是否影響單細胞的空間分布和基因表達，作者對BALB/c小鼠的4T1腫瘤進行了空間分辨轉錄組學研究。與之前的研究結果一致，ZNF689缺陷腫瘤在CIN評分中顯示出明顯且強烈的活性(圖5i)。如圖5j所示，在ZNF689缺陷點的腫瘤中，T細胞(包括CD4+和CD8+ T細胞)的特征評分、T細胞活化以及通過MHC-I進行的APP均較低且具有異質性。這些特征主要在ZNF689缺陷腫瘤的瘤周區域觀察到，表明免疫排斥的微環境更多。此外，原位LM2腫瘤中HLA-ABC、B2M、TAP1和PSMB9的免疫組化分析表明，ZNF689敲除后，MHC-I app相關標志物的下調主要是由于染色細胞百分比的降低，而不是染色強度的降低(圖5k)，表明ITH也誘導了MHC-I app相關蛋白表達的空間異質性。然而，使用LINE-1抑制劑EFV治療顯著消除了原位LM2腫瘤中ZNF689敲低導致的MHC-I app相關蛋白表達空間異質性的增加(圖5k)。

         為了進一步闡明ZNF689調控MHC-I app相關基因的具體機制，作者對Flag-ZNF689 ChIP-seq數據的分析顯示，ZNF689并不直接結合這些關鍵基因的啟動子。這與假設一致，即這種抑制與缺乏ZNF689時LINE-1逆轉錄轉位升高有關。為了評估ZNF689缺陷是否會由于MHC-I表達受損而限制CD8+ T細胞的細胞毒性活性，作者將小鼠卵白蛋白(OVA)特異性CD8+ T細胞(OT-I)與表達OVA的shNC和shZNF689 AT3腫瘤細胞一起培養(圖51)。腫瘤細胞中ZNF689的缺乏導致CD8+ T細胞的細胞毒活性和CD8+ T細胞活化的降低，如GZMB、IFN-γ和CD137的表達降低(圖5m)。這些數據對應于與shNC細胞相比，shZNF689 AT3腫瘤細胞中SIINFEKL (OVA肽)-H-2Kb復合物的表達減少(圖5m)。然而，當用LINE-1抑制劑EFV處理腫瘤-免疫細胞共培養系統時，作者發現腫瘤細胞的抗原呈遞和T細胞活化得到了恢復(圖5m)。綜上所述，這些數據表明，ZNF689缺陷誘導的ITH減少了抗原呈遞，抑制了T細胞的浸潤和活化，從而促進了TNBC的免疫逃逸和免疫治療抵抗。

6. LINE-1抑制使ZNF689缺陷誘導的高ITH腫瘤對免疫治療增敏

圖6 LINE-1抑制使ZNF689缺陷誘導的TNBC高ITH腫瘤對免疫治療增敏

         鑒于LINE-1抑制在調節ITH和抗原提呈中的重要性，作者進一步探索LINE-1抑制劑EFV是否可以逆轉免疫抑制的腫瘤微環境。然后將4T1細胞植入BALB/c小鼠的mfp中。在ZNF689缺乏組中，EFV顯著抑制腫瘤生長(圖6a)并延長存活時間(圖6b)，而不影響小鼠體重或食物消耗。EFV可有效降低ZNF689缺陷腫瘤的組織學ITH(圖6c)。通過流式細胞術，作者發現EFV處理的ZNF689缺陷腫瘤比Veh對照組有更多的CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、GZMB+和IFN-γ+ CD8+ T細胞(圖6d)。這些觀察結果表明，結合LINE-1抑制和免疫治療具有潛在的協同抗腫瘤作用。因此，作者在BALB/c小鼠中原位MFP移植了ZNF689敲低的4T1細胞，以研究靶向LINE-1是否能使高ITH腫瘤對抗pd-1治療增敏。雖然shNC組和shZNF689組之間的抗pd-1反應變化很，但與對照組相比，通過腫瘤體積評估，聯合治療在shZNF689組中顯示出協同抗腫瘤作用(圖6e)。此外，EFV聯合抗pd -1治療可顯著延長小鼠存活時間(圖6f)。原位4T1腫瘤顯示，聯合治療可顯著降低ZNF689缺陷腫瘤的組織學ITH(圖6g)。此外，作者檢測了聯合治療小鼠的微環境重塑；相關變化包括H2d MHC-I同種異體抗原水平(圖6h)、CD4+ T細和CD8+ T細胞的浸潤以及GZMB+和IFN-γ+ CD8+ T細胞的百分比(圖6i)的顯著增加。

         為了排除細胞系或小鼠株特異性效應，作者將AT3細胞原位注射到C57BL/6小鼠的mfp中，建立了AT3乳腺癌模型。作者再次觀察到，在使用LINE-1抑制劑EFV聯合抗pd-1治療的ZNF689缺陷組中，腫瘤生長延遲(圖6j)，生存時間延長(圖6k)。此外，聯合治療顯著降低了ZNF689缺陷腫瘤的組織學ITH，增強了抗原呈遞，并協調了CD8+ T細胞的浸潤和激活。這些數據表明，藥物抑制LINE-1結合免疫治療，通過阻斷ITH和增強抗原呈遞，促進腫瘤微環境中CD8+ T細胞的募集和激活，從而誘導有效的抗腫瘤免疫。

7. 在TNBC中，ZNF689的表達與良好的預后和免疫治療反應呈正相關

         為了進一步驗證作者在人類TNBC樣本中的臨床前發現，作者通過組織微陣列(n = 283)的免疫組化分析，研究了ZNF689、LINE-1和CD8在TNBC患者隊列中的表達水平。與作者的發現一致，免疫組化結果顯示，在TNBC組織中，ZNF689的表達與LINE-1 ORF1p水平呈負相關，但與CD8+ T細胞浸潤呈正相關(圖7a)。此外，作者的分析顯示，基于H&E染色，ZNF689的表達與組織學ITH水平呈負相關(圖7a)，這表明ZNF689是TNBC中與ITH相關的負相關因素。對于生存分析，作者觀察到低ZNF689水平在TNBC患者中的預后明顯差于相應的高ZNF689表達，這可以通過更短的OS、RFS和DMFS來證明(圖7b)。來自公共數據庫(Kaplan-Meier Plotter)的結果也顯示，低ZNF689表達與基底樣乳腺癌患者預后差相關。

圖7 在TNBC中，ZNF689的表達與良好的預后和免疫治療反應呈正相關

         此外，作者通過多色IF進一步評估了ZNF689、LINE-1、HLA-ABC和CD8在4個接受抗pd -1治療的TNBC試驗中腫瘤的蛋白表達水平(n = 100)。IF染色結果顯示，在抗pd -1治療應答者中，ZNF689與HLA-ABC和CD8表達呈正相關，而ZNF689與LINE-1 ORF1p表達呈負相關(圖7c)。重要的是，作者發現腫瘤中ZNF689的高表達與免疫治療的陽性反應相關(圖7d)。這些結果與作者的體外和體內研究一致。為了評估這些觀察結果是否也適用于其他類型的癌癥，作者檢查了接受抗pd -1治療的黑色素瘤數據集(GSE91061)和尿路上皮癌數據集(GSE176307)，觀察到應答者中ZNF689水平較高(圖7e)。與ZNF689損失的影響類似。總之，這些發現表明，ZNF689的表達與TNBC患者的預后和免疫治療反應呈正相關。

         總之，作者的研究闡明了潛在的機制，并揭示了一種靶向LINE-1的治療策略，通過與免疫療法的協同作用，可以使高ITH腫瘤被根除，為聯合使用LINE-1抑制劑和免疫療法進行TNBC精確治療提供了基礎。

實驗方法：

         遺傳ITH的定量， 組織學ITH定量， 質粒構建、轉染和慢病毒shRNA載體， DNA和RNA分析， Western blotting和co-IP， IF和多重IF，三維腫瘤球分析及組織學分析，小鼠腫瘤的WES，流式細胞術，SILAC標記和質譜，RNA測序和數據分析，逆轉錄轉位報告試驗，ChIP和ChIP-seq，免疫細胞與腫瘤細胞共培養試驗，scRNA-seq

參考文獻：

         Ge LP, Jin X, Ma D, Wang ZY, Liu CL, Zhou CZ, Zhao S, Yu TJ, Liu XY, Di GH, Shao ZM, Jiang YZ. ZNF689 deficiency promotes intratumor heterogeneity and immunotherapy resistance in triple-negative breast cancer. Cell Res. 2024 Jan;34(1):58-75. doi: 10.1038/s41422-023-00909-w. Epub 2024 Jan 2. PMID: 38168642; PMCID: PMC10770380.