免疫抑制腫瘤微環境(TMEs)降低了癌癥免疫反應的有效性。間充質間質細胞(MSCs)是癌癥相關成纖維細胞(CAFs)的前體，在結直腸癌(CRC)中通過增強免疫細胞抑制來促進腫瘤進展。多糖的高唾液酰化通過唾液酸與免疫細胞上表達的受體Siglecs結合，促進癌癥的免疫逃逸，從而抑制效應功能。唾液化在TME中形成MSC/ CAF免疫抑制中的作用尚未得到很好的表征。在這項研究中，作者發現腫瘤條件下的基質細胞增加了唾液基轉移酶，a2,3/6鏈唾液酸和Siglec配體的表達。腫瘤調節基質細胞和CAFs誘導耗盡的免疫調節性CD8+ PD1+和CD8+ siglece -7+ / siglece -9+ T細胞表型。在體內，靶向基質細胞唾液化可逆轉基質細胞介導的免疫抑制，如腫瘤和引流淋巴結中CD25和表達CD8+顆粒酶b的T細胞浸潤。靶向基質細胞唾液化可能克服CRC TME的免疫抑制。該文與2023年5月發布于《Cell Reports》，IF=8.8。

技術路線：

主要研究結果：

1、腫瘤條件下的基質細胞表面a2,3-和a2,6-鏈唾液酸水平升高

         MSCs可以通過可溶性免疫抑制分子的分泌以及細胞間接觸介導的免疫調節配體表達來感知和切換免疫反應。然而，間充質干細胞糖基化對其免疫調節潛能的影響尚未得到很好的表征。因此，作者試圖評估糖基化在msc介導的T細胞增殖和活化抑制中的作用。采用生物素化凝集素cona、Galanthus nivalis (GNA)、wheat germ凝集素WGA和sambuus nigra (SNA-I)，通過流式細胞術檢測各自聚糖結構的表達水平。圖1A顯示了每種凝集素優先結合的示意圖。與未染色的MSCs相比，唾液酸結合凝集素SNA-I和WGA在MSCs上的表達水平最高(圖1B)。唾液酸的兩個最常見的糖苷鍵是a2,3和a2,6。如圖1C示意圖所示，作者用CT26腫瘤細胞分泌組(CT26 MSCsTCS)調節小鼠MSCs，并分別用a2,3-和a2,6結合凝集素Maackia Amurenesis (MAL-II)和SNA-I孵育細胞，分析唾液酸的表達。流式細胞分析證實，MSCsTCS上a2,6，唾液酸的表達顯著增加，但a2,3，唾液酸的表達不明顯(圖1D)。通過RNA測序，作者分析了控制唾液化的酶的mRNA表達水平，即a2,3-和a2,6特異性唾液基轉移酶。圖1E和1F分別顯示了tcs條件和非條件MSCs之間a2,3和a2,6特異性唾液轉移酶的差異表達。這凸顯了唾液酸合成調控的復雜性，因為除了MSCsTCS增加了St3gal4的表達外，唾液基轉移酶mRNA的表達沒有明顯的趨勢。最后，在共培養實驗中，與無條件MSCs相比，MSCsTCS抑制CD4+和CD8+ T細胞增殖(圖1G)。在另一種腫瘤模型中也發現了類似的觀察結果，即MM的5T3MM模型。許多研究都強調了基質細胞(包括MSCs和CAFs)在調節實體和血液腫瘤免疫中的作用。CRC和MM出現在基質密集的微環境中，其中基質細胞特征與免疫抑制有關。為了評估體外調節是否再現了體內TME，作者直接從患病5T33MM小鼠的骨髓中分離并擴增基質細胞(MM MSCs)，并與野生型(WT) C57BL/ kalwrj來源的MSCs (MSCsControl)比較，評估其唾液酸表達(圖1H)。a2,3 (MAL-II)和a2,6 (SNA-I)唾液酸在5T33MM小鼠的MSCs中表達較高(圖1H)。5t33mm來源的MSCs也比wt來源的對照組具有更強的抑制作用，與對照組相比，可以顯著抑制CD4+和CD8+ T細胞的增殖(圖1I)。綜上所述，這些數據證實了兩個單獨TMEs中的基質細胞表達較高水平的a2,3和a2,6唾液酸，這與增強的免疫抑制有關。

圖1、腫瘤細胞分泌組誘導MSCs的唾液化

 2、腫瘤調節增強了基質細胞介導的CD8+ T細胞增殖和活化的抑制，通過靶向唾液基轉移酶活性來逆轉這一抑制

         雖然以前已經觀察到腫瘤細胞的高唾液化，但作者在這里表明基質細胞的唾液化也可以在TME中被調節。為了確定基質細胞唾液化的意義，作者比較了腫瘤條件下基質細胞與結腸癌上皮細胞的唾液酸表達(圖2A)。引人注目的是，與CT26上皮細胞相比，tcs條件下的基質細胞中a2,6唾液酸的基線水平明顯更高(圖2B)。為了評估這些唾液化蛋白對Siglec受體的結合親和力，作者使用了Siglec- e受體Fc嵌合體。siglece是人類siglec7 /9的同源物，由免疫細胞如T細胞、巨噬細胞和中性粒細胞表達。它在細胞質區域含有一個抑制性ITIM。siglece配體在MSCsTCS上的表達顯著高于對照MSCs(圖2C)。接下來，作者評估了靶向基質細胞唾液化對T細胞功能和表型的功能影響。為了實現這一點，作者使用了唾液基轉移酶抑制劑(SI) 3FaxNeu5Ac，一種唾液酸類似物。體外確定最佳SI濃度。SI預處理顯示細胞活力、粒度、大小或形態沒有顯著差異，但顯著降低了MSCsTCS上siglece配體、MAL-II和SNA-I的表達(圖2D)。腫瘤條件基質細胞用SI預處理，隨后與混合脾細胞或cd3分類T細胞共培養，以評估對T細胞的直接或間接影響(圖2A)。如圖2E-2H所示，MSCsTCS顯著抑制CD4+和CD8+ T細胞的增殖。SI處理部分逆轉了這種作用，在cd3分選共培養中，CD4+和CD8+ T細胞的增殖明顯恢復(圖2G和2H)。這些結果表明，唾液化在腫瘤誘導的msc介導的T細胞抑制中起關鍵作用。在cd3分類共培養中，免疫抑制作用更為顯著，表明MSC唾液化對T細胞有直接作用。接下來，作者評估了T細胞的活化和表型，重點關注兩種T細胞亞群的CD25和siglece表達。作者發現MSCsTCS在cd3分選T細胞培養物中顯著抑制CD4+ CD25+和CD8+ CD25+ T細胞(圖2K和2L)，但在混合脾細胞中沒有(圖2I和2J)。具體來說，CD8+ CD25+ T細胞頻率的恢復是通過抑制cd3分選T細胞培養基質細胞唾液化來觀察的(圖2L)。與MSCsTCS共培養對混合脾細胞培養中CD4+ siglece +或CD8+ siglece + T細胞的頻率有相反的影響，可能表明細胞間相互作用的復雜性。在混合脾細胞共培養中，當與MSCsTCS共培養時，CD4+ siglece + T細胞的頻率增加(圖2M)， SI沒有明顯的影響。然而，CD8+ siglece +細胞的頻率以唾液化依賴的方式增加(圖2N)。在cd3分類共培養中，當與MSCsTCS共培養時，CD4+ siglece +和CD8+ siglece + T細胞的反應相似(盡管CD8+ siglece + T細胞的總體百分比要高得多)(圖20和2P)。這種作用依賴于唾液酰化，因為SI的添加導致CD4+ siglece +和CD8+ siglece + T細胞的頻率顯著降低。總的來說，在MSCsTCS中，抑制唾液基轉移酶活性后，CD8+ T細胞表型發生了最顯著的改變。總的來說，這些數據表明，在腫瘤調節后，基質細胞唾液化會被誘導，從而增強基質細胞的免疫抑制，并可以決定CD8+ T細胞的表型、siglece的表達和功能。

圖2、腫瘤條件MSCs以唾液化依賴的方式抑制CD8+ T細胞效應表型

 3、在腫瘤條件基質細胞中靶向唾液化可誘導腫瘤內T細胞浸潤升高，并增強腫瘤引流淋巴結中的T細胞活化

         接下來，作者研究了靶向腫瘤基質細胞唾液化對體內免疫反應的影響。利用免疫活性的Balb/c皮下腫瘤模型，作者先前發現MSCs和CT26癌細胞共同給藥可促進腫瘤的發生和侵襲。為了評估靶向唾液化對早期免疫細胞浸潤的影響，作者在基質細胞存在或不存在、SI預處理或不預處理的情況下誘導CT26腫瘤。作者之前證明基質細胞誘導的腫瘤促進在誘導后16-18天是明顯的(數據未顯示);因此，為了評估靶向基質細胞唾液化對類似大小腫瘤早期免疫細胞浸潤的影響，作者在第13天評估了免疫表型。眾所周知，腫瘤浸潤性T細胞在許多類型的實體腫瘤(包括CRC)中具有很強的預后(例如，無病生存率和總生存率)意義。因此，作者將體外免疫細胞分析的重點放在CD4+和CD8+ T細胞頻率和表型上。循環T細胞表達低水平的抑制性siglece -9受體;然而，瘤內CD4+和CD8+ T細胞在黑色素瘤、非小細胞肺癌和結直腸癌中表達上調。作者的數據支持這一發現，因為作者證實，與引流淋巴結(DLN)、非引流淋巴結(NDLN)和脾臟中的T細胞相比，siglece在CD4+和CD8+腫瘤浸潤T細胞上均上調(圖3A和3B)。CT26腫瘤具有免疫原性，可被T細胞和先天免疫細胞浸潤。與單獨接受CT26細胞的小鼠相比，MSCsTCS顯著抑制了皮下腫瘤中表達cd25的活化CD4+和CD8+ T細胞的水平(圖3C、3E)。然而，注射前對MSCsTCS進行SI處理導致這種作用完全逆轉，激活T細胞恢復到與ct26處理小鼠腫瘤相當的水平。接下來，作者評估腫瘤內CD4+ siglece +和CD8+ siglece + T細胞的水平(圖3D, 3F)。結果與作者對表達cd25的T細胞的研究結果驚人地相似，MSCsTCS顯著抑制CD4+ siglece +和CD8+ siglece + T細胞，SI預處理逆轉了這種作用。考慮到siglece表達的增加通常與免疫抑制的增加有關，這些數據相當令人驚訝。然而，Haas及其同事在黑色素瘤患者中發現CD8+細胞毒性T細胞中siglece -9 (siglece的同系物)表達升高，這可能解釋了這一發現。此外，如圖3G所示，與未注射SI的小鼠相比，注射SI預處理的腫瘤條件MSCs的小鼠表達顆粒酶b的細胞毒性CD8+ T細胞水平也有所升高。考慮到腫瘤dln作為抗腫瘤發展的主要位點，以及它們在增強細胞毒性t淋巴細胞相關抗原4 (CTLA-4)和程序性細胞死亡蛋白1 (PD-1)阻斷功效方面的作用，研究越來越多地將注意力轉向腫瘤dln，以尋找強大的抗腫瘤免疫證據。因此，作者評估了DLN、NDLN和脾臟的T細胞浸潤情況。如圖4A、4C所示，聯合注射MSCsTCS，無論是否進行SI預處理，其對dln的影響與腫瘤內觀察到的效果相似(圖3D和3F);也就是說，MSCsTCS顯著降低了活化的CD4+ CD25+和CD8+ CD25+ T細胞的水平，SI預處理使水平恢復到基線水平。此外，與未注射SI預處理MSCsTCS的小鼠相比，共注射SI預處理MSCsTCS的小鼠DLNs中細胞毒性CD8+ T細胞顆粒酶B的表達顯著增加(圖4E)。有趣的是，與作者的腫瘤內觀察結果相反，聯合注射MSCsTCS，無論是否進行SI預處理，表達siglece的T細胞水平都不受影響(圖4B、4D)。作者對荷瘤小鼠脾臟中相同的T細胞表型的分析顯示了與dln相似的結果。這表明MSCsTCS和SI預處理的MSCsTCS分別誘導的抑制和隨后的抑制逆轉是對特定T細胞表型的特異性調節。通過比較dln和ndln中活化的CD4+和CD8+ T細胞頻率，進一步強調了這一點。雖然MSCsTCS聯合注射后，荷瘤小鼠DLNs中CD4+ CD25+和CD8+ CD25+ T細胞的頻率被抑制，但ndndns中CD4+ CD25+和CD8+ CD25+ T細胞的水平仍顯著升高(腹股溝;左側)(圖4F和4G)。此外，作者觀察到SI預處理的MSCsTCS小鼠中細胞毒性CD8+顆粒酶B+ T細胞的頻率增加，特別是在dln中觀察到。ndln無顯著性差異(圖4H)。作者的體內數據表明基質細胞具有強大的抑制作用。

圖3、去唾液酸化的腫瘤條件基質細胞增強了活化T細胞在瘤內的浸潤

圖4、唾液轉移酶抑制逆轉腫瘤條件基質細胞介導的T細胞抑制，并增加CD8+ T細胞在引流淋巴結中的顆粒酶B表達

 4、與TME上皮細胞相比，來自CRC腫瘤的人腫瘤條件MSCs和基質細胞表達更高水平的唾液基轉移酶、唾液酸和Siglec配體

         為了評估作者發現的臨床相關性，作者評估了人類結直腸癌組織病理標本中的基質和上皮細胞區域。T細胞定位評估顯示，CRC間質區CD3+和CD8+ T細胞密度明顯高于上皮區(圖5A和5B)。使用QuPath進行定量驗證，在結直腸腫瘤中，基質區相關的CD3+(圖5C，左)和CD8+ T細胞(圖5C，右)的數量明顯高于上皮區。接下來，作者使用人類數據集、人類腫瘤細胞系和基質細胞來分析人類結直腸癌組織中多種a2,3和a2,6特異性唾液基轉移酶的表達。作者分析了基因表達譜(GEO: GSE35602)，這些CRC切除樣本在微陣列譜分析之前被激光捕獲微解剖以分離基質和上皮部分。對該數據集中多個唾液轉移酶的評估表明，與上皮細胞區室相比，a2,3特異性唾液轉移酶ST3GAL1, ST3GAL4和ST3GAL6的表達與間充質譜系標記a-SMA (ACTA2)， vimentin (VIM)， CD90 (THY1)， PDGFR-a (PDGFRA)和CD105 (ENG)的共同表達更密切相關(圖5D)。ST3GAL1、ST3GAL4和ST3GAL6基因的相對表達量的定量證實了這一點，顯示這三個基因在基質部分的表達明顯高于上皮部分(圖5E)。a2,6特異性唾液轉移酶ST6GAL1和ST6GAL2的表達沒有明顯改變(圖5E)。此外，作者觀察到a2,6特異性ST6GALNAC6的表達顯著增加，它優先將唾液酸添加到糖脂中，而不是糖蛋白中，同時唾液酸酶NEU1顯著降低(圖5F)。為了擴展這些觀察結果，作者分析了從結直腸癌組織(CAFs)和鄰近正常粘膜組織(正常相關成纖維細胞[NAFs])中分離的患者匹配的原代成纖維細胞的轉錄譜(GEO: GSE70468)。雖然作者觀察到NAFs和CAFs之間ST3GAL1、ST3GAL4和ST3GAL6(數據未顯示)的表達水平沒有顯著差異，但與NAFs相比，CAFs中ST6GAL1和ST6GAL2的相對表達水平顯著升高(圖5G)。綜上所述，這些數據表明，與上皮細胞相比，結直腸癌微環境的間質室中a2,3連鎖特異性唾液轉移酶的水平升高。此外，在基質室中，與正常相鄰基質細胞相比，CAFs表達更高水平的a2,6連鎖特異性唾液轉移酶。為了探索基質細胞和Siglec受體之間的關聯，作者接下來訪問了cBioPortal，以評估作為基質細胞標志物的成纖維細胞激活蛋白(FAP)與人類免疫細胞已知表達的9種攜帶ITIM基序的Siglec受體之間的潛在相關性(圖6A)。本研究分析了594例結直腸癌基因組圖譜(TCGA)胰腺癌圖譜數據集中的患者。如圖6A和6B所示，根據Spearman相關系數，與FAP正相關最強的兩個Siglec受體是Siglec-9和Siglec-7(分別為0.66和0.63)。因此，作者使用siglece -7/9 Fc嵌合體評估了人骨髓來源的MSCs±HT29和HCT116 TCS調節(圖6C)對特異性siglece -7/9配體的表達。結果顯示，與癌細胞相比，tcs條件下的MSCs表達了更高水平的Siglec配體(圖6D和6E)。接下來，作者研究了臨床CRC標本中的基質細胞唾液化。從結直腸癌腫瘤中分離出CAFs，從腫瘤鄰近非癌組織中分離培養患者匹配的癌癥相關正常成纖維細胞(NAFs)(圖6F)。分析NAFs和CAFs中典型基質細胞表征標志物的表達情況。使用基于凝集素的流式細胞術，作者觀察到NAFs和CAFs表達a2,3唾液酸的水平相當;然而，a2,6唾液酸在cas中的表達明顯更高(圖6G)。特異性Siglec配體染色顯示，雖然NAFs和CAFs都表達Siglec-7配體，但CAFs上Siglec-9配體的表達量明顯更高(圖6H)。這些發現證明了siglecc配體在TME的基質細胞上表達，這可能調節了表達siglecc的免疫細胞的激活

圖5、與腫瘤上皮相比，結直腸癌腫瘤相關間質具有較高的T細胞浸潤和唾液轉移酶基因表達

圖6、腫瘤狀態的人MSCs和CRC腫瘤來源的cas唾液酸表達水平升高

 5、CAFs在CD8+ T細胞中誘導表達Siglec受體的耗盡表型，這是通過靶向唾液基轉移酶活性可逆的

         為了評估唾液化對基質細胞介導的免疫抑制的功能影響，作者將CRC患者來源的NAFs和CAFs與來自健康供者的外周血單個核細胞(PBMCs)或cd3分類的T細胞共培養(圖7A)。與單獨使用antid3 /CD28刺激的PBMCs相比，兩種基質細胞群均能顯著抑制CD4+和CD8+ T細胞的增殖。引人注目的是，即使在多次體外傳代后，CAFs的抑制作用也明顯強于NAFs(圖7B)。作者還觀察到，在與CAFs共培養后，表達siglece -7受體的細胞的總頻率顯著高于與NAFs共培養的細胞。接下來，作者用兩種不同的方法評估了脫氮化對caf誘導的CD8+ T細胞衰竭的影響。在與T細胞共培養之前，用si3faxneu5ac或唾液酸酶(裂解唾液酸)處理NAFs/CAFs。作者證實了siglece -9配體在si處理的CAFs上的顯著抑制作用。共培養后，作者分析了CD8+ siglece -7+和CD8+ siglece -9+ T細胞的頻率。如圖7C和7F所示，與受刺激的pbmc相比，CAFs分別誘導了更高水平的CD8+ siglece -7+和CD8+ siglece -9+ T細胞。此外，CAFs還誘導CD8+ PD-1+ T細胞的比例顯著增加(圖7I)，而CD4+ PD1+ T細胞的比例明顯增加。在共培養前用SI處理CAFs導致CD8+ siglece -7+和CD8+ siglece -9+ T細胞的頻率顯著降低(圖7D和7G)。這一效應是CAFs特有的，因為與NAFs±SI預處理共培養后，CD8+ T細胞群的頻率沒有變化(圖7D和7G)。作者使用唾液酸酶驗證了這些發現(圖7E和7H)，并觀察到CD8+ siglece -7+和CD8+ siglece -9+ T細胞具有相同的顯著作用。這是一個重要的發現，雖然體內系統給藥可能有腎毒性作用，但唾液酸酶耐受性良好，目前正在進行1/2期臨床試驗(Palleon Pharmaceuticals)。CAFs誘導CD4+ siglece -9+ T細胞的頻率更高，但是，與它對CD8+ T細胞的作用相反，SI預處理對逆轉這種增加沒有作用。作者觀察到，在與si處理的CAFs共培養中，CD8+ PD-1+ T細胞的頻率明顯下降(圖7J)，當用唾液酸酶處理時，CD8+ PD-1+ T細胞的頻率下降更為顯著(圖7K)。在這種情況下，效果不是CAF特異性的，因為作者觀察到唾液酸酶處理的NAFs也有類似的顯著降低(圖7K)。SI預處理對CD4+ PD-1+ T細胞水平無影響。最后，作者評估了唾液酸酶對與cd3分類T細胞直接共培養的NAFs和CAFs的影響。如圖7L和7M所示，CAFs誘導CD8+ siglece -9+ T細胞的頻率更高，而唾液酸酶的脫鹽作用顯著逆轉了這些作用。在CD8+ -PD-1+ T細胞中也觀察到類似的發現(圖7N和7O)。作者還證實，pbmc直接暴露于唾液酸酶對T細胞亞群沒有影響。這些結果表明，tme衍生的CAFs可以抑制活化的T細胞并促進CD8+ T細胞衰竭，并且這種免疫抑制作用可以通過調節基質細胞表面的唾液化而顯著逆轉。

圖7、CAFs在CD8+ T細胞中誘導唾液依賴的耗盡表型

結論

         總之，作者已經證明，不僅TME內的基質細胞高度唾液化，而且唾液聚糖在其免疫調節特性中發揮重要作用，抑制免疫細胞激活，這可能至少部分是由于與Siglec受體的相互作用。這些數據表明，降低MSCs唾液化的策略可能在CRC、MM和其他惡性腫瘤中具有重要的免疫激活作用，值得進一步研究。

 實驗方法：

         流式細胞術、T細胞擴增與活化實驗、共培養實驗、免疫組化、TCGA及GEO數據庫生信分析

參考文獻

         Egan H, Treacy O, Lynch K, Leonard NA, O'Malley G, Reidy E, O'Neill A, Corry SM, De Veirman K, Vanderkerken K, Egan LJ, Ritter T, Hogan AM, Redmond K, Peng L, Che J, Gatlin W, Jayaraman P, Sheehan M, Canney A, Hynes SO, Kerr EM, Dunne PD, O'Dwyer ME, Ryan AE. Targeting stromal cell sialylation reverses T cell-mediated immunosuppression in the tumor microenvironment. Cell Rep. 2023 May 30;42(5):112475. doi: 10.1016/j.celrep.2023.112475. Epub 2023 May 10. PMID: 37167967.