最近的觀察顯示，H3K27cr在結(jié)直腸癌（CRC）組織中上調(diào)；然而，根本原因仍然難以捉摸。本研究旨在探討H3K27cr上調(diào)的機(jī)制及其在CRC轉(zhuǎn)移中的作用。臨床上，我們的研究結(jié)果表明，H3K27cr是區(qū)分結(jié)直腸癌組織與健康對(duì)照的高度準(zhǔn)確的診斷標(biāo)志物。升高的LINC00887和H3K27cr水平與CRC患者較差的預(yù)后相關(guān)。在功能上，LINC00887和H3K27cr促進(jìn)了CRC細(xì)胞的遷移和侵襲。機(jī)制上，LINC00887與SIRT3蛋白相互作用。LINC00887過(guò)表達(dá)阻斷了GCN5啟動(dòng)子內(nèi)SIRT3的富集，從而使該區(qū)域的H3K27ac水平升高，而H3K27cr水平未升高，進(jìn)而激活GCN5的表達(dá)。這種激活提高了H3K27cr的總體水平，促進(jìn)了GCN5、H3K27cr和YEATS2在ETS1啟動(dòng)子內(nèi)的富集，激活了ETS1的轉(zhuǎn)錄，最終促進(jìn)了CRC的轉(zhuǎn)移。體內(nèi)研究表明，抑制LINC00887可抑制結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移，但當(dāng)小鼠接受NaCr治療時(shí)，這種抑制作用被消除。總之，我們的研究結(jié)果證實(shí)了H3K27cr在結(jié)直腸癌個(gè)體中的診斷生物標(biāo)志物潛力，并提出了一個(gè)功能模型來(lái)闡明LINC00887通過(guò)提高H3K27cr水平參與促進(jìn)結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移。本文于2024年10月發(fā)表于“Cell Death and Disease”（IF=8.1）上。

技術(shù)路線：

結(jié)果：

1）H3K27cr水平高與預(yù)后不良相關(guān)

我們檢測(cè)了97名結(jié)直腸癌患者癌組織及58名患者癌旁組織中H3K27cr的水平。結(jié)果顯示，癌組織的H3K27cr水平高于正常組織（圖1A-C）。我們研究了H3K27cr在區(qū)分結(jié)直腸癌組織與健康對(duì)照組中的潛在診斷價(jià)值。值得注意的是，ROC曲線分析顯示曲線下面積（AUC）值為0.9（圖1D）。此外，在我們之前的研究隊(duì)列中重復(fù)了這一分析，得到的AUC值為0.81（圖1E）。我們還評(píng)估了H3K27cr在區(qū)分遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者與無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者中的診斷價(jià)值，得到的AUC值為0.84（圖1F）。進(jìn)一步地，H3K27cr顯示出區(qū)分轉(zhuǎn)移部位與原發(fā)結(jié)直腸癌組織的能力，AUC值為0.75（圖1G）。特別值得注意的是，在伴有淋巴結(jié)侵犯的結(jié)直腸癌患者中，H3K27cr水平升高者的預(yù)后較差（圖1H）。

2）LINC00887提高H3K27cr水平

接下來(lái)，我們研究了lncRNAs是否調(diào)節(jié)H3K27cr修飾。我們從TCGA數(shù)據(jù)集中識(shí)別了結(jié)腸腺癌（COAD）中差異表達(dá)的基因，或者使用激光顯微切割技術(shù)獲得的結(jié)直腸癌患者的上皮細(xì)胞中的差異表達(dá)基因（GSE15960）。研究發(fā)現(xiàn)，在COAD組織和從結(jié)直腸癌細(xì)胞衍生的上皮細(xì)胞中分別有1573和4241個(gè)基因差異表達(dá)。將這兩個(gè)結(jié)果結(jié)合起來(lái)，發(fā)現(xiàn)了298個(gè)差異表達(dá)的基因，包括五個(gè)lncRNAs（圖2A）。使用GSEA分析檢查這五個(gè)lncRNAs與具有被H3K27cr占據(jù)的啟動(dòng)子的基因之間的關(guān)聯(lián)。這些發(fā)現(xiàn)表明，具有被H3K27cr占據(jù)的啟動(dòng)子的基因在上皮細(xì)胞或COAD組織中高表達(dá)LINC00887的情況下顯著富集（圖2B, C）。隨后，對(duì)來(lái)自單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄譜的上皮細(xì)胞進(jìn)行了類似分析。檢查了來(lái)自GSE110009數(shù)據(jù)集的總共8083個(gè)細(xì)胞，識(shí)別出15個(gè)不同的細(xì)胞亞型（圖2D）。具有被H3K27cr占據(jù)的啟動(dòng)子的基因在上皮細(xì)胞和Th0細(xì)胞中富集（圖2E）。GSEA結(jié)果顯示，在上皮細(xì)胞中高表達(dá)LINC00887的情況下，具有被H3K27cr占據(jù)的啟動(dòng)子的基因顯著富集，但在Th0細(xì)胞中則不然（圖2F）。接下來(lái)，我們通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)伴有淋巴結(jié)侵犯的結(jié)直腸癌患者中LINC00887的表達(dá)。結(jié)果表明，高LINC00887表達(dá)與預(yù)后不良顯著相關(guān)（圖2G）。Spearman相關(guān)性分析顯示LINC00887與H3K27cr水平之間存在正相關(guān)關(guān)系（圖2H）。LINC00887過(guò)表達(dá)增加了H3K27cr水平（圖2I）。相反，短暫和穩(wěn)定的LINC00887敲減產(chǎn)生了相反的效果（圖2J, K）。這些發(fā)現(xiàn)為LINC00887促進(jìn)H3K27cr水平提供了證據(jù)。

3）LINC00887通過(guò)誘導(dǎo)GCN5表達(dá)提高H3K27cr水平

接下來(lái)，我們研究了LINC00887增加H3K27cr的機(jī)制。GCN5在結(jié)直腸癌組織中顯著升高。研究發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定和短暫的敲低LINC00887會(huì)降低GCN5的表達(dá)，而過(guò)表達(dá)LINC00887會(huì)提高GCN5的表達(dá)水平（圖3A-C）。此外，一項(xiàng)涉及LINC00887質(zhì)粒和siGCN5共轉(zhuǎn)染的拯救實(shí)驗(yàn)恢復(fù)了H3K27cr水平（圖3D）。隨后，我們研究了GCN5啟動(dòng)子組蛋白H3K27修飾的改變。結(jié)果顯示，LINC00887過(guò)表達(dá)上調(diào)了該區(qū)域的H3K27ac水平，但沒(méi)有上調(diào)H3K27cr水平（圖3E）。為了研究LINC00887影響GCN5啟動(dòng)子上H3K27ac富集的分子機(jī)制，我們初步檢測(cè)了LINC00887在CRC細(xì)胞中的定位，揭示了主要的核定位。因此，我們假設(shè)LINC00887是否通過(guò)與乙酰化相關(guān)酶的相互作用調(diào)控GCN5啟動(dòng)子上H3K27ac的富集。隨后，進(jìn)行RIP實(shí)驗(yàn)以鑒定與LINC00887相互作用的蛋白。結(jié)果顯示SIRT3和LINC00887之間存在顯著的相互作用（圖3F）。這種相互作用通過(guò)RNA-FISH實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，顯示它們?cè)诩?xì)胞核中共定位（圖3G）。我們還觀察到，LINC00887過(guò)表達(dá)降低了GCN5啟動(dòng)子中SIRT3的富集，而LINC00887敲低則增加（圖3H）。這些發(fā)現(xiàn)表明LINC00887與SIRT3相互作用。它的過(guò)表達(dá)阻礙了SIRT3與GCN5啟動(dòng)子的結(jié)合，使該區(qū)域的H3K27ac水平升高，激活GCN5轉(zhuǎn)錄，最終使H3K27cr水平升高。

4）H3K27cr調(diào)節(jié)CRC組織上皮細(xì)胞的細(xì)胞粘附

我們研究了H3K27cr在調(diào)節(jié)侵襲中的作用機(jī)制。我們用NaCr處理結(jié)直腸癌細(xì)胞，并觀察到侵襲和遷移能力的增強(qiáng)（圖4A, B）。隨后，我們分析了Liao等人報(bào)道的具有被H3K27cr占據(jù)的啟動(dòng)子的基因的功能通路。共富集了20個(gè)通路，包括細(xì)胞間粘附通路。接著，進(jìn)行了單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNA-seq）分析，以評(píng)估這些20個(gè)通路在特定細(xì)胞類型中的存在情況。在GSE163974數(shù)據(jù)集中分析了總共1,688個(gè)細(xì)胞，識(shí)別出八個(gè)不同的細(xì)胞亞型（圖4C）。通過(guò)比較不同細(xì)胞亞型中的20個(gè)通路，觀察到細(xì)胞間粘附通路在來(lái)自結(jié)直腸癌組織的上皮細(xì)胞中特異性富集（圖4D）。這一結(jié)果在之前分析過(guò)的GSE221575數(shù)據(jù)集中得到了進(jìn)一步證實(shí)（圖4E）。用NaCr處理的結(jié)直腸癌細(xì)胞減少了E-鈣粘蛋白，同時(shí)誘導(dǎo)了N-鈣粘蛋白的表達(dá)（圖4F, G）。這一發(fā)現(xiàn)暗示H3K27cr可能通過(guò)其對(duì)細(xì)胞粘附的影響，在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。

5）LINC00887促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲和遷移

考慮到LINC00887對(duì)H3K27cr水平的促進(jìn)作用，我們研究了LINC00887對(duì)加速侵襲和遷移的影響。研究結(jié)果顯示，LINC00887過(guò)表達(dá)增加了CRC細(xì)胞的侵襲和遷移水平，而立即和持續(xù)敲低LINC00887可降低這些水平（圖5A-C）。此外，立即和持續(xù)敲低LINC00887可上調(diào)E-cadherin的表達(dá)，下調(diào)N-cadherin和vimentin的表達(dá)，而過(guò)表達(dá)LINC00887則對(duì)這些標(biāo)記物具有相反的作用（圖5D-F）。這些結(jié)果表明，LINC00887促進(jìn)了CRC細(xì)胞的侵襲和遷移。

6）LINC00887通過(guò)H3K27cr介導(dǎo)的細(xì)胞粘附分子促進(jìn)侵襲和遷移

我們研究了LINC00887是否通過(guò)H3K27cr調(diào)節(jié)侵襲和遷移。我們?cè)?/span>HCT116細(xì)胞中進(jìn)行了拯救實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)中轉(zhuǎn)染了siLINC00887并使用了10mM NaCr處理。結(jié)果顯示，NaCr處理恢復(fù)H3K27cr水平后，侵襲和遷移水平以及E-鈣粘蛋白、N-鈣粘蛋白和波形蛋白的水平也得到了恢復(fù)（圖6A, B）。此外，拯救實(shí)驗(yàn)表明，GCN5敲減恢復(fù)了LINC00887調(diào)節(jié)的E-鈣粘蛋白和波形蛋白水平（圖6C），這表明LINC00887通過(guò)GCN5/H3K27cr途徑調(diào)節(jié)結(jié)直腸細(xì)胞的侵襲和遷移。接下來(lái)，使用WGCNA在來(lái)自正常和結(jié)直腸癌組織的上皮細(xì)胞中識(shí)別了91個(gè)共表達(dá)模塊（圖6D）。在這些模塊中，有8個(gè)模塊在結(jié)直腸癌來(lái)源的上皮細(xì)胞中表達(dá)降低，而16個(gè)模塊表達(dá)增加（圖6E）。有10個(gè)模塊中的基因與EMT通路基因顯著相關(guān)。其中兩個(gè)模塊與602個(gè)基因表現(xiàn)出強(qiáng)烈的關(guān)聯(lián)（圖6F）。我們對(duì)GSE110009數(shù)據(jù)庫(kù)中602個(gè)以上的單細(xì)胞基因進(jìn)行了mapping分析。分析顯示，它們?cè)谡！⒔Y(jié)直腸癌和轉(zhuǎn)移組織的B細(xì)胞和上皮細(xì)胞中顯著富集（圖6G， H）。隨后，對(duì)這602個(gè)基因的生物學(xué)途徑進(jìn)行了注釋。結(jié)果表明，83條通路至少包含5個(gè)基因。在上皮細(xì)胞中比較這83種通路發(fā)現(xiàn)，CAMs在來(lái)自轉(zhuǎn)移組織的上皮細(xì)胞中表現(xiàn)出特異性富集（圖6I）。值得注意的是，這一結(jié)果在之前分析過(guò)的GSE225857數(shù)據(jù)集中得到了證實(shí)（圖6J）。這些發(fā)現(xiàn)表明，LINC00887通過(guò)H3K27cr調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)移組織上皮細(xì)胞的CAMs通路。

7）LINC00887通過(guò)提高YEATS2的募集來(lái)促進(jìn)ETS1的表達(dá)

ETS1調(diào)節(jié)CAMs基因的表達(dá)。我們接下來(lái)研究了LINC00887是否影響ETS1的表達(dá)。我們的觀察發(fā)現(xiàn)，LINC00887過(guò)表達(dá)增加了ETS1的水平，而LINC00887敲減則表現(xiàn)出相反的效果（圖7A–D）。此外，通過(guò)共轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞LINC00887質(zhì)粒和siETS1進(jìn)行了拯救實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)ETS1敲減恢復(fù)了侵襲和遷移的水平，以及E-鈣粘蛋白、N-鈣粘蛋白和波形蛋白的表達(dá)（圖7E, F），這表明LINC00887通過(guò)ETS1調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)移。接下來(lái)，我們研究了LINC00887對(duì)ETS1的調(diào)控機(jī)制。我們發(fā)現(xiàn)ETS1表達(dá)依賴于NaCr濃度，隨著NaCr濃度的增加，ETS1表達(dá)也增加（圖7G）。因此，對(duì)ETS1啟動(dòng)子的分析顯示，LINC00887過(guò)表達(dá)增加了GCN5、YEATS2和H3K27cr在這一區(qū)域的富集。相反，LINC00887敲減產(chǎn)生了相反的效果（圖7H–J）。拯救實(shí)驗(yàn)顯示，GCN5或YEATS2敲減恢復(fù)了LINC00887調(diào)節(jié)的ETS1表達(dá)（圖7K）。總的來(lái)說(shuō)，結(jié)果表明LINC00887增強(qiáng)了ETS1啟動(dòng)子中GCN5、H3K27cr和YEATS2的富集，激活了ETS1表達(dá)。

8）體內(nèi)抑制LINC00887可抑制結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移

最后，我們?cè)隗w內(nèi)研究了LINC00887在調(diào)節(jié)CRC轉(zhuǎn)移中的作用（圖8A）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抑制LINC00887能有效抑制HCT116細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。然而，當(dāng)用NaCr處理小鼠時(shí)，這種抑制作用被消除（圖8B， C）。此外，觀察到抑制LINC00887降低了GCN5， H3K27cr和vimentin水平。用NaCr處理后，這些減少被逆轉(zhuǎn)（圖8D， E）。總之，我們的研究結(jié)果表明，LINC00887和SIRT3之間的相互作用使SIRT3從GCN5啟動(dòng)子中移位。這種位移增加了GCN5啟動(dòng)子處的H3K27ac水平，激活了GCN5的表達(dá)，提高了H3K27cr的總體水平。因此，GCN5向ETS1啟動(dòng)子的募集增強(qiáng)，提高了該區(qū)域的H3K27cr水平。這種增強(qiáng)的富集進(jìn)一步促進(jìn)了YEATS2的募集，增加了ETS1的表達(dá)和CRC轉(zhuǎn)移（圖8F）。

結(jié)論：

LINC00887過(guò)表達(dá)促進(jìn)GCN5募集到ETS1啟動(dòng)子，導(dǎo)致H3K27cr富集并被YEATS2識(shí)別。最終，這一事件級(jí)聯(lián)導(dǎo)致ETS1轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)和CRC轉(zhuǎn)移。這些發(fā)現(xiàn)支持了LINC00887和H3K27cr在促進(jìn)結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移中的作用。

實(shí)驗(yàn)方法：

單細(xì)胞測(cè)序，Western blotting，qRT-PCR，Transwell，ChIP-seq，ChIP-qPCR，RIP，FISH，IHC。

參考文獻(xiàn)：

Liao M, Zheng W, Wang Y, Li M, Sun X, Liu N, Yao J, Dong F, Wang Q, Ma Y, Mou J. LINC00887 promotes GCN5-dependent H3K27cr level and CRC metastasis via recruitment of YEATS2 and enhancing ETS1 expression. Cell Death Dis. 2024 Sep 30;15(9):711. doi: 10.1038/s41419-024-07091-w.