RNA甲基化修飾（m6A）研究
RNA甲基化修飾（m6A）研究
RNA甲基化修飾約占所有RNA修飾的60%以上，而N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine, m6A）是高等生物mRNA和lncRNAs上最為普遍的修飾。目前發現microRNA，circRNA,rRNA, tRNA和snoRNA上都有發生m6A修飾。 m6A修飾主要發生在RRACH序列中的腺嘌呤上，其功能由“編碼器(Writer)”、“消碼器(Eraser)”和“讀碼器(Reader)”決定[1]。“編碼器(Writer)”即甲基轉移酶，目前已知這個復合物的成分有METTL3，METTL14, WTAP和KIAA1429；而ALKBH5和FTO作為去甲基酶（消碼器）可逆轉甲基化；m6A由m6A結合蛋白識別，目前發現m6A結合蛋白（讀碼器）有YTH結構域蛋白（包括YTHDF1, YTHDF2,YTHDF3， YTHDC1和YTHDC2）和核不均一蛋白HNRNP家族（HNRNPA2B1和 HNRNPC）。
m6A酶系統
METTL3是早先被鑒定為結合SAM的組件，其缺失引起小鼠胚胎干細胞、Hela細胞和HepG2 細胞中m6Apeaks的減少。METTL3及其同源蛋白METTL14定位在富含剪切因子的細胞核內亞細胞器－核小斑（Nuclear speckle）上，顯示ｍ６Ａ修飾可能和ＲＮＡ的剪切加工相關。WTAP與METTL3–METTL14 二聚體相互作用，并共定位于核小斑，影響甲基化效率，參與mRNA剪。而KIAA1429作為候選的甲基轉移酶復合體的新亞基，是整體甲基化進程所必須的[2]。FTO是ALKB家族的成員，作為第一個被發現的去甲基酶，可影響剪切因子SRSF2的RNA結合能力，進而調控pre-mRNA的剪切加工過程[3]。目前已發現FTO調節異常與肥胖、大腦畸形和生長遲緩相關， 揭示m6A可能對這些疾病具有重要的調節功能[4-6]。ALKBH5是ALKB家族中被發現具有去甲基作用的另一個成員，以RNase A敏感的方式與核小斑共定位，它可直接催化m6A-甲基化腺苷去除甲基而不同于FTO的氧化去甲基化[7].此外，ALKBH5和它的去甲基化活性影響新生mRNA合的成和剪切效率[7]， 且ALKBH5敲除雄性小鼠表現出精子發生異常，這可能是精子發生相關基因表達改變的結果[7]。m6A mRNA修飾執行其功能主要通過兩個途徑： 精細調控甲基化轉錄本的結構，以阻止或誘使蛋白-RNA 相互作用；或被直接由 m6A 結合蛋白識別，誘發后續反應。目前一類含有YTH功能結構域的蛋白被鑒定為m6A修飾的結合蛋白。其中YTHDF1, YTHDF2, YTHDF3，YTHDC1和YTHDC2己被證實是ｍ６Ａ的結合蛋白.YTHDF1主要影響ｍ６Ａ修飾基因的翻譯，YTHDF2主要影響ｍ６Ａ修飾基因的降解，而YTHDC1結合ｍ６Ａ修飾的基因后影響其剪接。HNRNPC是一種豐富的核RNA結合蛋白，參與pre-mRNA的加工[8]，且研究表明HNRNPC通過m6A與 RNA結合調控目標轉錄本的豐度和選擇性剪切[9].
圖 1 m6A修飾的酶系統[10]
m6A生物學功能
越來越多的證據表明m6A修飾在哺乳動物中發揮重要的生物功能。例如，在轉錄后水平上調控RNA的穩定性[11]、定位[12]、運輸、剪切[13]和翻譯[14]。Claudio R. 等發現依賴METTL3的pri-miRNA甲基化，會促進DGCR8識別和加工，從而促進microRNA的成熟[15]。此外，m6A識別蛋白 HNRNPA2B1促進 pri-miRNA 加工成 pre-miRNA[16]。另外，環狀RNA上m6A的修飾能促進環狀RNA的翻譯[17]。m6A修飾在基因表達調控中起著重要的作用，其調控機制的異常可能與人類疾病或癌癥相關。目前發現m6A可能會影響精子發育（ALKBH5，METTL3，Ythdc2）、發育（METTL3、FTO、ALKBH5）、免疫（METTL3）、UV誘導的DNA損傷反應（METTL3，FTO）、腫瘤生成（YTHDF2）或轉移（METTL14）、干細胞更新（METTL14）、脂肪分化（FTO）、生物節律、細胞發育分化、細胞分裂及其它的一些生命過程。例如，ALKBH5敲除的雄性小鼠增加了mRNA中的m(6)A修飾，其特點是凋亡影響減數分裂中期的精子細胞，引起生育能力受損[7]。METTL3和METTL14增加弱精癥精子的m6A水平[18]，在生殖細胞中，METTL3的敲除嚴重抑制精子分化和減數分裂的發生，轉錄組和m6A分析顯示 精子發生相關基因的表達和選擇性剪接發生了改變[19]。YTHDC2可促進靶基因的翻譯效率，并降低其mRNA的豐度，在精子發生過程中起關鍵作用。當減數分裂開始時YTHDC2表達上調，YTHDC2敲除小鼠的生殖細胞沒有經過偶線期的發育導致小鼠不育[20]。在DNA損傷反應中，METTL3可促進DNA聚合酶κ（Pol κ）與核酸剪切修復途徑快速定位到UV引起的DNA損傷位點，當缺失METTL3時，細胞無法迅速修復UV照射引起的突變，并且對UV照射更加敏感[25]。在淋巴細胞性小鼠過繼轉移模型中， Mettl3缺陷通過影響mRNA m6A修飾，降低SOCS家族mRNA衰減，增加mRNA和蛋白表達水平，從而抑制IL-7介導的 STAT5活性和T細胞內穩態增殖和分化，進而抑制腸炎的發生[21]。在肝癌中，METTL14 通過調控pri-miRNA的m6A修飾，影響MiR-126的生成加工，從而抑制肝癌的轉移[22]。在乳腺癌細胞中，低氧刺激能促進依賴低氧誘導因子HIF的ALKBH5的表達，而ALKBH5過表達降低了NANOG mRNA的m6A修飾，從而穩定mRNA提高NANOG的表達水平，最終增加乳腺癌干細胞所占的比例[23]。 此外，低氧誘導乳腺癌細胞中依賴ZNF217的NANOG 和KLF4 的mRNA m6A甲基化抑制，且ALKBH5敲除顯著降低免疫缺陷小鼠乳腺癌的肺轉移[24]。在肺癌中，METTL3能夠促進肺腺癌細胞的生長、生存和侵襲，但還不清楚它是否作為 m6A 調節器或效應器發揮作用[25]。在急性髓細胞白血病（AML）患者中，m (6) A 調控基因的突變或拷貝數變化與TP53 突變存在密切聯系，且m (6) A 調控基因的改變與AML不良預后相關[26]。此外，FTO在AML中高表達，它通過降低mRNA轉錄本中的m(6)水平，調節ASB2和RARA等靶點的表達，增強了白血病癌基因介導的細胞轉化和白血病形成，并抑制全反式維甲酸(ATRA)誘導的AML細胞分化[27]。在脂肪形成過程中，FTO表達與m6A水平成負相關，促進脂肪形成[3]。在膠質細胞瘤樣細胞中，ALKBH5通過lncRNA FOXM1介導FOXM1基因pre-mRNA上的m6A修飾維持膠質瘤細胞的成瘤性[28]。此外，甲基轉移酶METTL3或METTL14的敲除，能夠改變m6A的富集和ADAM19的表達，極大地促進了膠質瘤細胞的生長、自我更新和腫瘤形成[29]。
圖2 m6A RNA修飾和介導的功能[30]
m6A 的研究方向
主要是通過研究 m6A修飾相關的甲基化、去甲基化酶和識別蛋白的功能，進而研究m6A修飾的生物學功能和作用機制：一般通過敲除m6A酶分子，研究下游功能基因分子的表達和m6A甲基化情況，通過介導相關基因異常（可變剪切、穩定性、翻譯、miRNA 調控）影響細胞表型和功能特征。
m6A修飾圖譜構建及作用機制：通過m6A甲基化測序（MeRIP-Seq, miCLIP）構建疾病細胞模型或者發病組織的 m6A 修飾譜，分析m6A的motif, peaks數量及分布，Peak 關聯基因的特征，聯合RNA-seq研究m6A甲基化與表達的關系。
m6A研究思路
方案一
方案二
研究案例
1、m6A Demethylase ALKBH5 Maintains Tumorigenicity of Glioblastoma Stem-like Cells by Sustaining FOXM1 Expression and Cell Proliferation Program. Cancer Cell 2017.(IF=27.4)
DNA甲基化異常是膠質瘤的表觀遺傳調控因子，但RNA甲基化在腫瘤包括惡性膠質瘤（GBM）中的調控還尚未清楚。為研究m6A調節可能導致GBM患者臨床療效不佳，作者通過TCGA數據庫，發現ALKBH5在惡性膠質瘤樣干細胞（GSCs）中高表達且與GBM 病人不良預后相關，干擾ALKBH5 降低GSCs細胞的自我更新能力且抑制GSCs增殖，進一步體內驗證敲除ALKBH5可抑制腫瘤生長。
為研究ALKBH5的m6A作用機制，作者利用芯片和m6A-seq篩選到膠質瘤增殖相關的FOXM1，最后通過qPCR、WB、免疫熒光、核質分離WB/qPCR、RIP和MeRIP等實驗證明ALKBH5通過去甲基化調節FOXM1在GSCs中的表達。
為研究ALKBH5對FOXM1的作用是否受其他因子的調節，作者研究了FOXM1的鄰近基因，發現lncRNA FOXM1-AS與FOXM1序列互補，且共表達、共定位，進一步通過RIP, RNA pull down等實驗證明lncRNA FOXM1-AS促進ALKBH5 和FOXM1初級轉錄本的相互作用。最后通過細胞實驗進一步驗證ALKBH5在lncRNA FOXM1-AS的作用下維持FOXM1的表達和細胞增殖，從而維持GSCs的干性。
圖3 ALKBH5敲除細胞中m6A修飾的特征和基因表達的變化
2、RNA N6-methyladenosine methyltransferase METTL3 promotes liver cancer progression
through YTHDF2 dependent post-transcriptional silencing of SOCS2. Hepatology,2017.(IF=13.2)
表觀遺傳改變極大地促進了人類癌癥的發生。傳統的表觀遺傳研究主要集中在DNA甲基化，組蛋白修飾和染色質重構。最近，RNA各種可逆的化學修飾被認為是一種新的表觀遺傳調控方式。m6A是真核生物mRNA最常見的化學修飾，在調控mRNA穩定性，剪切和翻譯方面具有重要的作用。
作者使用轉錄組測序發現了METTL3（甲基轉移酶3），一種主要的RNA N6-腺苷-甲基轉移酶，在人肝細胞癌（HCC）和多種實體腫瘤中顯著高表達。在臨床上，METTL3的過度表達與肝細胞癌患者不良預后有關。體外實驗證明敲除METTL3會顯著抑制HCC細胞增殖，遷移及克隆形成。體內實驗證明敲除METTL3會明顯抑制HCC體內成瘤和肺轉移。另外，使用CRISPR/dCas9-VP 64激活系統，內源性高表達METTL3會顯著促進HCC細胞在體外和體內生長。通過轉錄組測序、m6A-Seq、MeRIP-PCR，作者確定了SOCS2（細胞因子信號2的抑制因子）作為METTL3介導的m6A修飾的下游靶基因。 敲除METTL3表達會消除SOCS2 mRNA m6A修飾并增強SOCS2 mRNA表達。m6A介導的SOCS2 mRNA降解是依賴于m6A“讀取器”蛋白YTHDF2。總之，METTL3在HCC大部分高表達中,并通過m6A-YTHDF2依賴機制抑制SOCS2表達從而促進HCC進展。因此，作者發現了在肝腫瘤發生過程中表觀遺傳改變的一種新機制。
圖4 RNA甲基化轉移酶METLLT3在肝癌組織中高表達
（轉錄組測序結果及TCGA數據庫分析）
圖5 RNA-Seq和m6A-seq聯合鑒定SOCS2是METTL3
介導的m6A修飾的下游靶基因
3、N6-adenosine methylation in MiRNAs. PLoS One 2015,
在許多不同種類的RNA中，都已觀察到N6 -腺苷(m6A)的甲基化，但其在microRNAs中還沒有被研究。研究者在FTO1C1, FTO2D4 和 FTO3C3細胞系中，通過敲除m6A甲基轉移酶FTO篩選到表達差異的microRNA,說明miRNA受m6A甲基化的調控。進一步通過MeRIP-Seq發現相當一部分的microRNA具有m6A修飾。通過motif分析，他們發現了區分甲基化和非甲基化microRNA的一致序列。該文章所述的表觀遺傳修飾在基因表達的轉錄后調控的復雜性上增加了一個新的層次。
圖6 FTO敲除對甲基化的miRNAs的穩定狀態的影響。
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