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大鼠心肌細胞 RCM

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大鼠心肌細胞 RCM

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   高度分化的心肌細胞幾乎沒有分裂能力,它們在a-腎上腺素的刺激下通過Ras/MEK途徑發生肥大生長。所有的心肌細胞都能自律性的將膜去極化和復極化。所有的心肌細胞收縮都是肌源性的,不受神經系統刺激。心肌細胞具有復雜的信號網絡,從而調節其在心臟節律性的泵出功能中的作用。心力衰竭時,心肌細胞的肥大和凋亡導致心肌收縮功能的下降。更好地了解心臟信號系統有助于揭示心肌細胞死亡的細胞機制。

   RCM是從出生2天大鼠的心臟分離得到的,原代凍存,冰凍運輸。每管細胞密度超過1×10^6/ml。細胞特性經肌球蛋白(myosin)、sacromeric alpha-actinin 和原肌球蛋白免疫熒光鑒定。本細胞經檢測不含支原體、細菌、酵母菌和真菌。如采用ScienCell實驗室提供的培養條件,可保證此細胞繼續的培養。HCM因為不能增殖,故不能夠擴大或長期培養。

分離方法:

大鼠心肌細胞比乳鼠心肌難養,用無血清培養基,呈桿狀,橫紋清楚,在培養基里細胞不搏動。大鼠心肌細胞分離一般是采用二型膠原酶分離,濃度為1mg/ml(用無鈣臺氏液配制),同時酶液里加入牛磺酸,BSA。一般采用Langendorff灌流的方法,大鼠開胸后,迅速取出心臟,放入冰的臺氏液中,找到主動脈后,掛上Langendorff裝置,衡流泵灌入無鈣臺氏液(37度),開始心臟會搏動幾下,這樣把心臟中的淤血擠出(此處也有人用有鈣臺氏液灌流,好讓心臟充分搏動,把淤血擠出,不過我們摸索發現只要取心臟到掛上去的時間短,一般搏動幾下就能把淤血清楚干凈了)。

幾分鐘后,換酶液開始灌流心臟,一般開始時,心臟較軟,待消化一段時間后變硬,繼續消化后又變軟,且心臟發白,這時候就可以停止消化,將心室剪下,放入KB液中,用剪刀剪碎后,用滴管吹打,取上清,繼續加入KB液,吹打,直到上清液不渾濁為止,一般吹打3-4次即可。將各次上清合并,吹打過濾后,沉降20分鐘左右,棄上清,加入無血清培養基(MEM,不含L-谷氨酰胺,并加入肌酸,牛磺酸,BSA,肉毒堿,HEPES),吹打,1000轉/分離心半分鐘,棄上清,再洗1-2次后,將沉淀加入到6%的BSA中沉降15-20分鐘(純化心肌細胞),然后計數,點板或培養。

此法中如果各步注意無菌操作,最后先用加倍雙抗的培養基培養24h后,再換正常培養基,可適用于條件不是很好的試驗室。如果能在板或瓶內加入Laminin處理后,貼壁很好。如果分離出來的心肌細胞,逐級復鈣后培養,狀態更好。最佳狀態此中方法能培養7天以上。


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