LncRNA-mRNA整合分析

1．LncRNA簡要

LncRNA是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200nt的RNA，它們本身并不編碼蛋白，而是以RNA的形式在多種層面上（表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等）調(diào)控基因的表達水平。生物體內(nèi)含量相相當豐富，約占RNA的4-9%（mRNA約占1-2%）。LncRNA的組織特異性及特定的細胞定位，顯示lncRNA受到高度嚴謹?shù)恼{(diào)控，目前已知其與發(fā)育、干細胞維持、癌癥及一些疾病相關(guān)。雖然近年來隨著基因芯片及第二代高通量測序技術(shù)的廣泛運用，lncRNA不斷被發(fā)現(xiàn)，但此類轉(zhuǎn)錄本的確切功能還未知。目前市場上的lncRNA芯片通常將lncRNA與mRNA設(shè)計在一起，RNASeq數(shù)據(jù)中也包含lncRNA, mRNA序列，因此可以通過分析lncRNA與mRNA表達相關(guān)性對lncRNA進行功能注釋。 

2．分析流程圖

3. 分析內(nèi)容

①計算LncRNA與mRNA表達相關(guān)性，根據(jù)設(shè)定的域值篩選lncRNA與mRNA關(guān)系對，構(gòu)建LncRNA與mRNA共表達網(wǎng)絡(luò)，如下是全局網(wǎng)絡(luò)

 ②基于lncRNA與mRNA表達相關(guān)性以及l(fā)ncRNA與mRNA基因組位置近鄰關(guān)系，得到lncRNA的潛在靶標基因，對差異表達的lncRNA靶標基因進行功能注釋以及功能富集分析，如下是功能富集的GO的Barplot圖和差異lncRNA的Heatmap圖

③研究lncRNA與mRNA的共表達網(wǎng)絡(luò)的拓撲學特性，基于度篩選網(wǎng)絡(luò)拓撲上重要的lncRNA，這些lncRNA極有可能是與研究背景相關(guān)的lncRNA，如下是重要lncRNA與mRNA的局部共表達子網(wǎng)絡(luò)

 ④客戶提供研究背景相關(guān)一組基因，根據(jù)表達相關(guān)性可以找出與這組基因相關(guān)的lncRNA，從而構(gòu)建出感興趣的共表達網(wǎng)絡(luò)。通過構(gòu)建的共表達網(wǎng)絡(luò)能進一步找到感興趣的 hub  lncRNA。

 

lncRNA深度挖掘分析

一、差異lncRNA靶基因預(yù)測

lncRNA的靶基因較為復雜,主要分為正式和反式兩種作用機制.lncRNA作用機制與miRNA類似,均可以通過調(diào)控相應(yīng)的mRNA來行使功能,所以靶基因的預(yù)測在科學研究中都顯得非常必要。

二、靶基因Gene Ontology分析
我們將靶基因向gene ontology數(shù)據(jù)庫的各節(jié)點映射,計算每個節(jié)點的基因數(shù)目.

三、靶基因Pathway分析

信號通路分析需要完備的注釋信息支持，通過整合KEGG、Biocarta、Reactome等多個數(shù)據(jù)庫的信息可以精確檢驗來進行Pathway的顯著性分析。

四、lncRNA與調(diào)控基因的表達機制

通過整合lncRNA的信息和靶基因之間的關(guān)系,我們可以得到一個lncRNA與靶基因之間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖.

五、 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點預(yù)測

對于差異表達lncRNA，提取轉(zhuǎn)錄起始位點上下游序列,使用預(yù)測程序?qū)ζ滢D(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點進行預(yù)測.

六、基因關(guān)聯(lián)分析

現(xiàn)在市面上的lncRNA芯片均含有mRNA的表達探針,通過將lncRNA的靶基因分析結(jié)果與芯片上mRNA的表達結(jié)果做關(guān)聯(lián)分析,可以更進一步的分析lncRNA的功能。

七、信號通路調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建：

實驗中基因同時參與了很多Pathway，通過構(gòu)建信號通路調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，從宏觀層面看到Pathway之間的信號傳遞關(guān)系，在多個顯著性Pathway中發(fā)現(xiàn)受實驗影響的核心Pathway，以及實驗影響的信號通路之間的調(diào)控機理。

八、lncRNA的功能分析

根據(jù)lncRNA最新的功能數(shù)據(jù)庫，利用生物信息學工具，做出Function-Tar-Net圖表，從而得出lncRNA與功能的關(guān)系

lncRNA功能實驗

1、LncRNA定量PCR

2、LncRNA原位雜交

3、5’-RACE, 3’-RACE實驗(lncRNA全長擴增實驗)

4、lncRNA干擾實驗

5、lncRNA過表達實驗

需要先通過5’-RACE實驗找到lncRNA轉(zhuǎn)錄起始位點

6、lncRNA細胞功能實驗

細胞增殖、細胞凋亡、細胞周期、細胞遷移