導語：骨是一個動態器官，通過破骨細胞和成骨細胞的協調產生自我修復潛力。衰老過程中骨的自我修復能力明顯受損。間充質骨祖細胞（OPCs）向骨形成表面的遷移是成骨細胞生成的初始步驟，OPCs的遷移能力在衰老過程中是否受到損害，以及它如何促成衰老相關的骨形成減少仍不清楚。今天，lncRNA粉墨登場，演繹著不一樣的精彩故事。

參考文獻：Targeting long noncoding RNA PMIF facilitates osteoprogenitor cells migrating to bone formation surface to promote bone formation during aging （IF=8.579）

技術路線：

結果

1. 衰老過程中骨形成減少伴隨OPCs向骨形成表面遷移減少，lnc-PMIF表達升高

收集衰老小鼠模型的骨標本，分析動態骨組織形態，發現老年小鼠的礦化沉積率(MAR)和骨形成率(BFR/BS)均顯著降低，表明衰老期間小鼠的骨形成減少。從小鼠中分離出BMSCs，RNA-Seq分析發現老年BMSCs中遷移相關基因均下調。老年和年輕小鼠BMSCs成骨誘導7d后ALP活性和成骨誘導14d后鈣礦物質沉積相當，表明BMSCs的成骨潛能在衰老過程中沒有改變。再次從老年和年輕小鼠中分離BMSCs，Dil染色劑標記后體外增殖，脛骨內注射到另一批年輕小鼠中，三天后收獲脛骨對成骨標志物Runx2進行熒光免疫染色。發現老年BMSCs處理的小鼠中Dil標記細胞降低，表明老化過程中OPCs向骨形成表面的遷移能力降低。大部分遷移到骨形成表面的Dil標記細胞表達Runx2，表明OPCs遷移到骨形成表面發生成骨分化，有助于體內骨形成。與年輕BMSCs相比，老年BMSCs的體外遷移能力明顯受損，Macf1顯著下調，從Macf1基因位點轉錄而來的長鏈非編碼RNA PMIF（即lnc-PMIF）表達顯著增高。上述提示，衰老過程中小鼠骨形成的減少伴隨著OPCs向骨形成表面遷移的減少和OPCs中lnc-PMIF表達的升高。

2. Lnc-PMIF抑制OPCs遷移到骨形成表面

在成骨細胞分化過程中，lnc-PMIF在早期增加，在礦化啟動后減少，表明lnc-PMIF可能在成骨分化的早期階段發揮作用。過表達/敲低lnc-PMIF不影響OPCs的增殖和成骨分化。敲低lnc-PMIF的細胞遷移減弱，敲低組細胞處理的小鼠脛骨中Dil標記細胞數量升高，小鼠中lnc-PMIF表達更高。這些表明lnc-PMIF可抑制OPCs向骨形成表面的遷移，而不干擾其增殖和成骨潛能。

3.Lnc-PMIF與HuR相互作用抑制β-actin的表達以抑制OPC遷移

為探索Lnc-PMIF介導的OPC遷移的調節機制。RNA pull down-MS實驗尋找lnc-PMIF的相互作用蛋白，鑒定出一種RNA結合蛋白HuR，WB證實HuR在生物素標記的lnc-PMIF細胞裂解的下拉組分中富集，RNA免疫沉淀(RIP)試驗lnc-PMIF與HuR的結合。還檢測到β-肌動蛋白顯著升高，與免疫沉淀的HuR蛋白結合。接下來研究HuR-β-actin介導的調節機制是否參與OPC的遷移調節。β-actin的mRNA和蛋白表達以及細胞遷移能力在HuR基因過表達的細胞中顯著增加， HuR基因敲低細胞中降低。β-肌動蛋白的mRNA和蛋白表達在lnc-PMIF過表達細胞中顯著下調，但在lnc-PMIF基因敲除細胞中顯著上調，表明lnc-PMIF能抑制OPCs中β-actin的表達，基因過表達/敲除lnc-PMIF不改變HuR的蛋白表達。在前述lnc-PMIF敲低細胞中敲低HuR基因，細胞中β-actin的mRNA和蛋白表達顯著下調，細胞遷移能力也受到損害，這些數據表明lnc-PMIF可與HuR相互作用，抑制β-actin的表達來抑制OPC遷移。

4. lnc-PMIF與HuR的RRM3結合，中斷HuR-β-actin mRNA相互作用，抑制β-actin表達，抑制OPC遷移

為闡明lnc-PMIF如何與HuR相互作用調節β-actin表達和OPC遷移，首先通過生物信息學分析預測了lnc-PMIF的二級結構，并合成生物素化的全長lnc-PMIF（WT）和截短的lnc-PMIF突變體，分別為突變體A1（無5’莖環的正義）、突變體A2（有中心莖環和3’莖環的正義）和突變體A3（僅有3’莖環的正義1100-1455 bp），轉染MC3T3-E1細胞，并進行標記RNA鏈霉親和素下拉試驗。蛋白免疫印跡分析顯示，HuR存在于轉染WT lnc-PMIF、截短lnc-PMIF突變體A1或截短lnc-PMIF突變體A2的細胞的下拉部分中，但在轉染截短lnc-PMIF突變體A3的細胞的下拉部分中不存在。這些數據表明，lnc-PMIF的中心莖環足以實現lnc-PMIF和HuR之間的相互作用。

接下來，我們合成了野生型HuR蛋白(WT)和HuR蛋白的截短突變體（即分別為單獨HuR的RNA識別基序(RRM)1的突變體B1、單獨HuR RRM2的突變體B2和單獨HuR RRM3的突變體B3）（圖4 C）。同時，我們設計并合成了生物素標記的或未標記的探針，分別特異性靶向lnc-PMIF的中心-莖環和生物素標記的或未標記的探針，特異性靶向之前報道的與HuR蛋白相互作用的β-actin mRNA的序列。RNA電泳遷移率變動分析(EMSA)發現只有當生物素標記的lnc-PMIF探針與WT HuR或截短突變體B3共孵育時，才能檢測到lnc-PMIF-HuR復合物，這表明HuR的RRM3可介導HuR和lnc-PMIF之間的相互作用。lnc-PMIF與β-actin mRNA競爭與HuR相互作用。過表達HuR-RRM3后細胞中β-actin的mRNA和蛋白表達下降顯著上調，遷移活性增強。所有這些表明lnc-PMIF可與HuR的RRM3結合，中斷HuR-β-actin的相互作用，抑制β-actin的表達，抑制OPC的遷移。

5. 沉默lnc-PMIF促進老年OPCs向骨形成表面遷移，促進老年小鼠骨形成

BMSCs中沉默lnc-PMIF，增殖無變化，OPCs成骨能力不改變，細胞遷移數量高，表明沉默lnc-PMIF可增強老年OPCs的遷移能力，而不干擾老年OPCs的體外增殖和成骨分化。接受si-PMIF處理的老年BMSCs的小鼠中骨形成表面Dil +細胞數顯著升高，提示沉默lnc-PMIF可促進老年OPCs在體內向骨形成表面遷移，大部分遷移的Dil +細胞中檢測到Runx2表達，表明si-PMIF處理的老年BMSCs遷移到骨形成表面發生正常的成骨分化，這將有助于小鼠的骨形成。接受si-PMIF處理的老年BMSCs小鼠骨表面TGF-β+細胞的平均積分光密度顯著更高，而TRAP+面積無顯著差異，表明si-PMIF處理的老化BMSCs可能影響細胞募集，而不是骨吸收。上述si-PMIF或si-NC處理的老年BMSCs對老年雄性小鼠進行脛骨內注射，4周后接受si-PMIF處理的老年BMSCs的小鼠骨量更高，脛骨干骺端微結構更好，BMD和BV/TV更高，MAR和BFR/BS更高。這些結果證明，老年BMSCs敲低lnc-PMIF可促進骨形成。

6. 靶向遞送lnc-PMIF siRNA接近骨形成表面的OPCs促進老年小鼠骨形成

接下來評價lnc-PMIF在骨形成表面周圍的老年OPCs中系統靶向沉默對衰老相關骨質疏松的影響。為促進lnc-PMIF siRNA（即si-PMIF）接近骨形成表面周圍的OPCs，si-PMIF或si-NC被包裹在骨形成表面靶向遞送系統（即，(DSS6)-脂質體）。21月齡自然衰老的雄性和雌性小鼠靜脈注射 (DSS6)-脂質體-si-PMIF、(DSS6)-脂質體-si-NC或(DSS6)-脂質體單藥（溶劑）。si-PMIF處理組Gli1 +細胞中lnc-PMIF的表達顯著降低，si-PMIF處理組兩種性別小鼠的骨量更高，脛骨干骺端微結構更好，BMD和BV/TV更高，MAR和BFR/BS較高。這些發現表明，靶向沉默骨形成表面周圍OPCs中的lnc-PMIF可以促進衰老相關骨質疏松小鼠的骨形成。