2021年5月，最新一篇發表在cancer research（IF=12.7000）的文章（YTHDF1 Promotes Gastric Carcinogenesis by Controlling Translation of FZD7）。此研究分析了cBioPortal (cBio cancer Genomics Portal)630例原發性胃腺癌數據集，發現YTHDF1（m6A讀取蛋白）的突變主要是基因擴增，導致其過表達。YTHDF1的高表達與更具侵襲性的腫瘤進展和較差的總生存期相關。抑制YTHDF1在體內外均可抑制胃癌細胞增殖和腫瘤發生。在機制上，YTHDF1以m6依賴的方式促進了Wnt關鍵受體frizzled7 (FZD7)的翻譯，突變的YTHDF1增強了FZD7的表達，導致Wnt/b-catenin通路的過度激活，促進了胃癌的發生。我們的研究結果表明，YTHDF1及其m6a介導的Wnt/b-catenin信號通路在胃癌中的致癌作用，為靶向此類表觀遺傳調控因子提供了一種新的方法

背景：超過100個不同的RNA修改特征已經在過去的幾十年里,其中,該N6-methyladenosine (m6A)修改是最豐富的形式在真核mRNA。不同的m6A讀者蛋白優先區分轉錄組范圍內的RNA m6A景觀。在細胞質中，大多數YTH (YTHDF1-3和YTHDC2)和IGF2BP (IGF2BP1- 3)家族蛋白與m6a修飾的mrna結合并調節其穩定性和翻譯。此外，其他蛋白質可以結合m6a修飾的前體rna在細胞核內，并影響其加工。

m6a相關基因缺陷影響多種生物過程。例如，metttl3的缺失導致受損的胚胎干細胞退出自我更新走向分化;抑制METTL14導致明顯的胚胎生長遲緩;斑馬魚胚胎中YTHDF2的消融延遲了早期胚胎發育中的母-合子過渡。特別是，RNA m6a相關基因正在成為在各種癌癥中促進腫瘤啟動和進展的關鍵調控因子，包括肺癌中的metttl3、肝癌中的metttl14、白血病中的FTO和乳腺癌中的ALKBH5。然而，m6A如何調節癌變以及下游通路和機制如何傳遞這些信號尚不完全清楚。

技術路線：

YTHDF1的增加通過加速Wnt受體基因FZD7的翻譯促進胃癌的發生，導致Wnt通路以m6a依賴的方式激活

一、YTHDF1在胃癌中的過表達

通過評估YTHDF1突變的分布，我們發現65%的突變是基因擴增，這通常會導致基因產物的過表達(圖1A).通過對TCGA數據集進行分析，發現YTHDF1在胃癌患者中的表達確實明顯高于正常組織(圖1B)。YTHDF1的高表達與胃癌進展(圖1C)和較差的總生存期(圖1D)相關。對正常胃組織和胃癌標本進行免疫組化分析，證實腫瘤組織中YTHDF1蛋白表達上調(圖1F)。此外，YTHDF1在胃癌患者中的異常高表達與更嚴重的臨床病理特征(如神經周圍侵犯、侵襲性腫瘤分期(III/IV期vs. I/II期)、靜脈侵犯等顯著相關(圖1G）。Kaplan Meier生存分析也顯示，YTHDF1高表達的胃癌患者4年總生存期較差。

綜上所述，YTHDF1在胃癌發生中具有潛在的致瘤作用。

二、YTHDF1缺乏可抑制胃癌進展和轉移

YTHDF1在不同胃癌細胞株中的蛋白表達水平，遠高于正常胃腺細胞GES-1。為了進一步探討YTHDF1在胃癌中的作用，采用了胃癌細胞系、細胞系來源的異種移植(CDX)和PDX模型(圖2A)。首先，通過產生兩種穩定的shRNA表達人胃癌細胞株MGC-803和HGC-27，研究了YTHDF1的抑制作用，這兩種細胞株在所有被檢測的胃癌細胞株中YTHDF1的表達相對較高(補充圖S2B)。YTHDF1基因敲除確實降低了胃癌細胞的增殖(圖2B)。此外，在MGC-803和HGC-27細胞中YTHDF1敲除降低細胞的遷移和侵襲能力(圖2C)。隨后通過皮下注射YTHDF1敲除的MGC-803細胞到免疫缺陷裸鼠，研究YTHDF1的抑制是否會影響體內胃癌的發生。YTHDF1水平的降低導致MGC-803移植腫瘤的腫瘤進展延遲(補充圖S2D和S2E)；與對照組相比，YTHDF1缺陷腫瘤的重量和體積顯著減少(圖2D)。因此，在YTHDF1缺陷腫瘤中，增殖標記物Ki-67下調，凋亡標記物cleaved caspase-3上調(圖2E)。通過兩種轉移模型探討YTHDF1是否參與了胃癌的體內轉移。尾靜脈注射MGC-803-sicontrol細胞導致肺轉移，而注射MGC-803-siYTHDF1l細胞幾乎完全消除轉移淋巴結的形成。最后建立了PDX模型，發現敲除YTHDF1抑制了腫瘤的生長和重量。

上述結果表明YTHDF1在胃癌發生中起重要作用。

三、通過RNA-seq、RIP-seq和MeRIP-seq鑒定ythdf1調控的轉錄本

對YTHDF1基因敲除MGC-803細胞和對照細胞進行RNA-seq。RNA圖譜顯示YTHDF1抑制導致轉錄異常(圖3A)?；虮倔w論(GO)分析表明，下調的基因在血管生成、細胞遷移、粘附和細胞生長等方面富集;而定位于負調控腫瘤進展的基因表達上調(圖3B)。RIP-seq獲得了9082個結合YTHDF1的候選基因。我們分析了功能富集變化最顯著的前3000個基因，表明它們高度參與了癌癥相關途徑(圖3C)。但累積分布分析表明，YTHDF1結合基因與YTHDF1未結合基因在轉錄水平上沒有顯著差異(圖3D)。這與之前的研究結果一致，即YTHDF1主要調控基因翻譯。MeRIP-seq鑒定YTHDF1調控的m6A修飾的轉錄本。2365個轉錄本檢測到m6A修飾，主要發生在mrna中(98%;圖3 e;補充表S7)，優先聚集在外顯子(58%;圖3 e)。與其他n6 -甲基腺苷測序結果一致，m6A峰在30UTR區域富集(圖3F)，并僅被典型GGAC基元檢測(圖3G)。將RIP-seq和MeRIP-seq整合的重疊轉錄本進行富集分析，發現Wnt和Hippo信號通路受到了顯著影響(圖3H）。假設YTHDF1抑制通過Hippo或Wnt途徑抑制腫瘤生長(圖3I)。

四、FZD7是YTHDF1中真正的m6A修飾靶標

對于顯著腹肌Hippo或Wnt通路的13個轉錄本，我們采用了多步驟篩選策略(圖4A)。使用RIP結合qPCR驗證確定YTHDF1相互作用的轉錄本（4B）。Wnt途徑的FZD1、FZD7、CTBP2、MAPK9、MAP3K7等轉錄本，以及Hippo途徑的TP53BP1、PARD3、SMAD2、SMAD3等轉錄本均被YTHDF1抗體特異性免疫沉淀(4C)。YTHDF1基因敲除僅顯著降低了FZD7、MAPK9、SMAD2、SMAD3和PARD3的蛋白水平(圖4D)，但它們的mRNA未受影響。m6A免疫沉淀反應(m6A-IP)和YTHDF1 eCLIP和qPCR證實YTHDF1 對FZD7, MAPK9, SMAD2 SMAD3,和PARD3 mrna進行m6A修飾。FZD7的翻譯效率下調最顯著，而其他基因的翻譯效率均出現輕微的抑制(圖4G)。這些結果共同提示FZD7是YTHDF1在胃癌中真正的直接靶點。

五、YTHDF1以m6a依賴的方式調控FZD7的表達

   在GC-803和胃癌細胞株基礎上，進行m6A-qPCR和YTHDF1 RIP qPCR的基因特異性分析。確實，在FZD7 mRNA中觀察到兩個m6A峰，并且在MGC-803和HGC-27細胞中證實了與YTHDF1的關聯(圖5A和B)。標記YTHDF1突變體(YTHDF1- mut)具有兩個關鍵氨基酸突變(K395A, Y397A)以消除其m6binding口袋(44)，將其轉染到MGC-803和HGC- 27細胞中(圖5C)。在YTHDF1野生型(YTHDF1- wt)轉染的胃癌細胞中觀察到的FZD7表達上調在YTHDF1- mut中被消除，但在YTHDF1-WT和YTHDF1-MUT兩種細胞系中，FZD7的mRNA水平相當(圖5E)。RIP-qPCR分析顯示，FZD7 mRNA與突變體YTHDF1的相互作用明顯受損(圖5F)。為了進一步探討m6A修飾在FZD7 mRNA中的作用，我們構建了三種FZD7突變體，其中一種突變體為第一個m6A峰(FZD7- peak1 Mut)，另一種突變體為第二個m6A峰(FZD7- Peak2 Mut)，以及雙突變體(FZD7- peak1 &2 Mut;圖5)。與野生型相比FZD7 (FZD7-WT)突變在第二m6A峰和雙m6A峰值突變(FZD7-Peak2傻瓜和FZD7-Peak1&2Mut)野生型YTHDF1沒有反應過度(7和8)圖5 h,面板,建議第二m6A峰FZD7 YTHDF1的主要網站的監管。同樣，m6a結合能力的喪失完全消除了YTHDF1促進FZD7 mRNA翻譯的作用(圖5H，圖9 12)。這些結果表明YTHDF1介導的FZD7的翻譯控制依賴于m6A修飾。

六、THDF1通過FZD7調控Wnt/b-catenin通路

   A，典型Wnt/b-catenin通路示意圖。B, YTHDF1敲低或過表達MGC-803和HGC-27細胞中總(B -catenin)和非磷酸化(Ser33/37/Thr41, activated B -catenin) B -catenin的蛋白水平。C, IF染色分析YTHDF1敲低、過表達或突變過表達的MGC-803和HGC-27細胞中總(紅色)和激活的(綠色)b-catenin的亞細胞定位。D，免疫印跡分析b-catenin靶基因、HMGA2、cyclin D、CDC25A、COX2、SOX9、VEGFA在YTHDF1敲低、過表達或突變過表達MGC-803和HGC-27細胞中的表達。E，定量分析YTHDF1敲低和過表達MGC- 803和HGC-27細胞中b-catenin靶基因的RNA水平(n =3)。

七、YTHDF1-FZD7-b-catenin軸促進胃癌進展

   A和B, Western blot分析YTHDF1、FZD7、B -catenin和激活的B -catenin在YTHDF1敲低的MGC-803 (A)和HGC-27 (B)細胞中轉染FZD7構建物或空載體對照。C和D，如上所述MGC-803 (C)和HGC-27 (D)細胞的增殖。E，如上所述MGC-803(左)和HGC-27(右)細胞的遷移分析。F，如上所述MGC-803(左)和HGC-27(右)細胞的侵襲分析。G，熱圖顯示YTHDF1, FZD7，(總)b-catenin在人胃癌樣本中的表達結果(n= 79)。H, YTHDF1、FZD7和(總)b-catenin在人胃癌樣本中的表達的相關性分析(n= 79;Pearson和Spearman相關檢驗)。I，三對胃腫瘤及鄰近正常組織中YTHDF1、FZD7、活化b-catenin的代表性IHC芯片結果。J，胃癌患者YTHDF1、FZD7、(total) b-catenin (low, n 39; high, n 40)及總生存率Kaplan Meier分析(log-rank with Mantel Cox test)。K，顯示YTHDF1如何調節b-catenin信號通路促進胃癌進展的示意圖。