piRNA-30473通過調控DLBCL中m6A RNA甲基化而促進腫瘤發生和不良預后
彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)是最常見的淋巴惡性腫瘤亞型，它的開始和進展受遺傳和表觀遺傳的畸變控制。N6-甲基腺苷(m6A)作為最豐富的真核信息RNA修飾，通過調控靶基因影響多種基礎生物過程；然而，m6A修飾在DLBCL中的作用尚不清楚。此外，piwi相互作用RNA (piRNAs)已被證明是癌癥的表觀遺傳效應。目前，有研究發現piRNA-30473通過調控DLBCL中m6A RNA甲基化而促進腫瘤發生和不良預后，該研究于2021年3月發表在《Blood》雜志，IF為17.543。
技術路線：
1. piRNA-30473在DLBCL中升高，是DLBCL患者的不良預后因素
作者首先研究小RNA的表達水平與DLBCL患者的臨床相關性。通過分析微陣列數據，與預后不良組(PP)比較，在預后良好(FPP)的病例中發現了4個顯著下調或上調的piRNAs(圖1A)。在這四個差異表達RNA的基礎上，作者進一步發現與預后良好(FPP)的患者相比，預后不良患者(PP)的piRNA-30473表達水平顯著升高(圖1B)，且DLBCL患者高水平的piRNA-30473與較差的總生存率相關(圖1C)。綜上所述， piRNA-30473可作為預后的生物標志物，并可用于DLBCL患者的預后分層。
圖1 piRNA-30473在DLBCL中升高，是DLBCL患者的不良預后因素
為了進一步探索piRNA-30473在DLBCL中的功能作用，作者使用antiagomir-30473在DLBCL細胞中去除piRNA-30473。結果發現，與對照組相比，在DLBCL細胞中耗盡piRNA-30473導致增殖減少(圖2A)。此外，細胞周期分析顯示，在DLBCL細胞中抑制piRNA-30473可以增加G1期細胞的比例，減少S期和G2期細胞的比例(圖2B, 2C)。然而，耗盡piRNA-30473并不誘導細胞凋亡(圖2D)。此外，通過SU-DHL-8異種移植DLBCL模型，以評估piRNA-30473對體內DLBCL進展的影響(圖2E)。結果發現，抑制piRNA-30473抑制腫瘤增長 (圖2F)。這些數據表明沉默piRNA-30473可以抑制DLBCL細胞在體內和體外的活性。
圖2 抑制piRNA-30473可降低DLBCL的發生
3. piRNA-30473通過調控WTAP的表達介導m6A的甲基化
為了進一步探討piRNA-30473在DLBCL中轉錄組調控中的作用，我們在轉染antiagomir-30473后48 h檢測m6A整體甲基化水平。結果顯示，轉染antiagomir-30473的細胞總體m6A水平降低(圖3A, 3B)。METTL3, METTL14, WTAP, FTO 和ALKBH5是關鍵的m6A甲基轉移酶或去甲基化酶，它們的失調可能導致DLBCL中m6A修飾譜異常。結果發現，抑制piRNA-30473降低了WTAP的表達(圖3C,3D)，而其他蛋白表達無明顯差異。同時，免疫共沉淀表明，antiagomir-30473處理降低了WTAP與METTTL3和METTTL14的相關性(圖3E)。
接下來為了證明piRNA-30473在WTAP mRNA中是否存在結合位點，作者先使用miRNA特異性靶檢測算法確定假定的結合位點(圖3F)，后續實驗結果證明，piRNA-30473通過與WTAP的3’-UTR結合，降低了WTAP mRNA的衰減，進而增強了mRNA的穩定性(圖3G,3H)。
圖3 piRNA-30473通過調控WTAP的表達介導m6A的甲基化
4. WTAP是DLBCL中piRNA-30473的一個功能重要的靶基因
作者研究WTAP是否在DLBCL的臨床結果中發揮了關鍵作用，并使用免疫組化分析來評估DLBCL患者樣本中WTAP蛋白的表達。免疫組化和GEO數據庫分析均顯示WTAP表達升高預示DLBCL患者預后不良(圖4A,4B)。另外耗盡WTAP也可誘導生長抑制和細胞周期阻滯，且無凋亡跡象(圖4C, 4D, 4E,圖4F)。通過過表達WTAP可在很大程度上挽救對piRNA-30473的抑制作用。這些數據表明WTAP是piRNA-30473的重要功能靶點，并在DLBCL中發揮致癌作用。
圖4 WTAP是DLBCL中piRNA-30473的一個功能重要的靶基因
5. 利用高通量RNA-seq和m6A-seq鑒定WTAP靶基因
為了進一步驗證WTAP介導的m6A甲基化對DLBCL細胞的影響，對對照組和WTAP缺失的SU-DHL-8細胞進行m6A測序(m6A-seq)。結果發現，一致motif DRACH在免疫純化的RNA中富集(圖5A)，m6A位點主要存在于外顯子和3’-UTR中，且m6A位點在終止密碼子附近富集程度最高(圖5B)，并通過篩選差異表達基因中出現的m6A低甲基化峰，鑒定出136個基因(圖5C)。
HK2基因有助于腫瘤高糖酵解率，同時DLBCL在缺氧脅迫下促進生長需要HK2。GSEA分析表明，WTAP的潛在靶基因與缺氧信號顯著相關 (圖5D)，提示HK2是DLBCL中WTAP的關鍵靶基因。m6A-seq數據顯示，WTAP靶向HK2轉錄本的5’-UTR, WTAP的敲除導致5’-UTR的m6A水平顯著下降(圖5E)。最后作者為了驗證HK2是否是WTAP靶基因，通過構建熒光素酶報告載體和CRISPR/CAS9敲除實驗，證明了HK2是WTAP在DLBCL中的直接下游靶點(圖5F,5G,5H,5I,5J)。
圖5 利用高通量RNA-seq和m6A-seq鑒定WTAP靶基因
6. WTAP介導的HK2調控依賴于其m6A甲基化酶活性
m6A閱讀器IGF2BP2識別WTAP轉錄本中的m6A位點，以促進其穩定性。qPCR結果顯示，IGF2BP2缺陷細胞中HK2的轉錄水平顯著降低(圖6A)，mRNA穩定性實驗顯示HK2在IGF2BP2缺陷細胞中趨于不穩定(圖6B)。pGL3-HK2-WT載體的熒光素酶活性通過抑制IGF2BP2而降低，而pGL3-HK2-MUT載體的熒光素酶活性則消失(圖6C)。因此， IGF2BP2與WTAP共同作用，影響DLBCL細胞中HK2 mRNA的穩定性和表達。此外，考慮到piRNA-30473在腫瘤發生和疾病進展中的功能重要性，利用選擇性抑制劑靶向piRNA-30473/WTAP/HK2軸可能是治療DLBCL的一種有前景的治療策略(圖6D)。
圖6 WTAP介導的HK2調控依賴于其m6A甲基化酶活性
結論：
作者證明了piRNA-30473通過調節m6A RNA甲基化，從而觸發下游信號級聯而促進DLBCL的腫瘤發生和不良預后。該研究強調了m6A修飾機制在DLBCL中的功能重要性，并通過揭示一個之前未被發現的DLBCL基因調控機制，為腫瘤發生的表觀遺傳機制提供了深刻的見解。
參考文獻：
Han H, Fan G, Song S, Jiang Y, Qian C, Zhang W, Su Q, Xue X, Zhuang W, Li B. piRNA-30473 contributes to tumorigenesis and poor prognosis by regulating m6A RNA methylation in DLBCL. Blood. 2021, 137(12):1603-1614.