癌癥代謝被重新連接，以支持細胞生存，以應對內在和環境的壓力。鑒定靶向這些適應機制的策略是一個活躍的研究領域。作者此前發現GOT1驅動通路在胰腺癌中維持氧化還原平衡。在這里，作者試圖鑒定GOT1抑制后的大寫依賴以表征胰腺癌的特征并為氧化還原代謝提供新的見解。本文于2021年8月發表在《Nature Communications》IF：14.919期刊上。

技術路線

主要實驗結果：

1、PDA細胞利用GOT1促進細胞增殖和腫瘤生長

作者此前的工作證明，胰腺導管腺癌（PDA）細胞重新連接蘋果酸-天冬氨酸穿梭線以生成NADPH（Fig. 1a）。為了確定GOT1在PDA中使用時間控制，作者使用dox敲除分別GOT1的編碼區和3’UTR（sh1和sh3），以及對照shNT。結果顯示sh1和sh3顯著敲除GOT1的表達并細胞集落形成（Fig. 1b, c）。在18個細胞系中，有12個細胞系的GOT1敲除顯著損害了菌落形成（Fig. 1d）。但是對GOT1敲除的響應不依賴于蘋果樹-天冬氨酸穿梭酶的表達狀態。然后檢測GOT1對已建立的小鼠PDA腫瘤的抑制作用。結果顯示，dox誘導GOT1敲除后，GOT1敏感細胞株表現出明顯的生長抑制（Fig. 1e, f）。這些結果表明PDA利用GOT1促進細胞增殖和腫瘤生長。

圖1 對于細胞增殖和腫瘤生長來說GOT1是PDA必須的

2、限制外源性胱氨酸可增強GOT1抑制

由于與非轉化細胞相比，GOT1抑制在PDA中具有獨特的細胞抑制作用，因此作者試圖識別由GOT1敲低誘導的代謝缺陷，從而靶向殺死PDA。為了該目的，作者檢測了GOT1敲低PDA細胞對代謝靶向小分子反應的敏感性。對細胞進行5天的dox處理以確保GOT1敲除，然后再進行3天的藥物處理（Fig. 2a）。與一些抑制劑聯合使用時，GOT1抑制是有保護作用的，表現為曲線值下的面積增加，這是一種藥物敏感性的測量（Fig. 2b）。5種最常用的脫敏劑中有3種是化療藥物，這與之前的觀察結果一致。相比之下，GOT1敲除增強了erastin的敏感性（Fig. 2b, c）。Erastin是胱氨酸/谷氨酸逆向轉運系統的抑制劑，它將胱氨酸轉運到細胞中以交換谷氨酸。胱氨酸，半胱氨酸的氧化二聚體，在進入細胞后被還原為半胱氨酸，在細胞內它可以促進谷胱甘肽和蛋白質的合成，以及許多其他生化命運。GOT1敲除增強了PDA細胞系的erastin敏感性（Fig. 2d）并且與dox是否干擾無關。這種GOT1增強效應被erastin類似物咪唑酮erastin (IKE) 復制，而和IKE聯合處理可導致部分細胞毒性（Fig. 2e）。與單一處理組相比，erastin或IKE處理GOT1敲除細胞減少了細胞數量，但這可以通過補充外源性半胱氨酸、谷胱甘肽來源GSH-EE或NAC而反轉（Fig. 2f）。這與胱氨酸導入到系統xc維持谷胱甘肽水平至關重要的結果一致。在PDA腫瘤中胱氨酸水平是有限的。在腫瘤相關中培養細胞以胱氨酸時間和劑量依賴的方式增強了GOT1的下調（Fig. 2g）。胱氨酸對GOT1敲除小鼠PDA生長的影響與體外實驗結果一致?？傊?，在GOT1抑制后，PDA培養物對外源性胱氨酸戒斷敏感。

圖2 GOT1抑制之后細胞活力和生長PDA離不開胱氨酸

3、抑制谷胱甘肽的生物合成可增強GOT1基因下調的生長抑制作用

谷胱甘肽（GSH）可以由半胱氨酸重新合成，也可以由氧化的谷胱甘肽(GSSG)經NADPH還原再生（Fig. 3a）。GOT1抑制導致GSSG和NADP+增加，而GSH和NADPH隨細胞系而異。因此，作者推測抑制谷胱甘肽的生物合成可能增強GOT1敲除。GSH合成的限速步驟可以被BSO抑制。在24小時的藥物處理后，GOT1的抑制有效地增強了對BSO的敏感性，與單藥反應溫和效應相比，并且BSO暴露72 h會放大這增強作用（Fig. 3b, c）。抑制GOT1可增強BSO對增殖作用（Fig. 3d）。通過補充外源性GSH-EE或NAC可恢復上述對細胞活力的組合效應（Fig. 3e），表明氧化還原失衡。GOT1敲除和BSO暴露對細胞的組合作用在小鼠體內同樣適用（Fig. 3f, g）?？傊?，數據表明，在GOT1敲除的條件下，PDA需要谷胱甘肽的合成來維持生存和生長。

圖3在GOT1抑制下，PDA的生長需要谷胱甘肽的合成

4、GOT1抑制增強鐵死亡的敏感性

先前的研究表明，某些細胞類型對erastin和BSO敏感，這些藥物可以通過消耗GSH來殺死細胞。GSH消耗的近端效應是通過GPX4活性的喪失介導的，GPX4利用GSH作為輔助因子來解毒脂質過氧化物（Fig. 4a）。這可導致脂質過氧化物的致命積累和鐵死亡。雖然GOT1抑制不能誘導鐵死亡，但本文的數據表明它可能為PDA細胞誘導鐵死亡。

為了研究GOT1是否能使PDA對鐵死亡敏感，首先檢測GOT1與RSL3的組合效應，RSL3是GPX4的共價抑制劑和鐵死亡的直接誘導劑。RSL3聯合GOT1敲除比單獨使用更有效（Fig. 4b）。GOT1增強了一組PDA細胞系的鐵死亡，這種作用與dox效應無關（Fig. 4c）。此外，RSL3聯合GOT1敲除顯著降低細胞增殖而增強了細胞毒性（Fig. 4d）。然后使用C11- BODIPY脂質過氧化傳感器來研究GPX4和GOT1抑制如何影響脂質過氧化。單獨抑制GOT1可導致適度的脂質ROS，但與RSL3或erastin聯合使用可增強脂質ROS的積累；這種增強作用可通過與親脂抗氧化劑鐵抑制素-1 (Fer-1)共同處理逆轉（Fig. 4e）。

隨后，作者檢測了GOT1對鐵死亡的作用是否可以通過與緩解脂質過氧化或螯合鐵的藥物共同處理來抑制。與Fer-1聯合處理在可以抑制多個小分子的GOT1增強效應，用親脂抗氧化劑，Trolox，或鐵螯合劑脫鐵胺(DFO)處理，可以為細胞提供顯著的保護作用（Fig. 4f）。為了排除凋亡、壞死或自噬細胞死亡機制的可能性，用這些細胞死亡途徑的特征明確的抑制劑共同抑制GOT1，結果顯示，與Trolox或DFO相比，這些抑制劑對細胞的保護作用非常有限?？偟膩碚f，這些數據表明，在細胞培養中，GOT1抑制啟動了PDA的鐵死亡。

圖4 GOT1抑制增強鐵死亡

5、GOT1抑制通過促進不穩定鐵誘導PDA鐵死亡

研究表明代謝紊亂導致細胞內儲存的鐵自適應釋放，以支持線粒體的能量代謝。考慮到鐵死亡的易感性與游離鐵的可得性有關，作者假設細胞內鐵水平可能會隨著GOT1抑制介導的能量應激而增加。作者通過測量Calcein-AM來驗證這一假設，Calcein-AM是一種熒光素衍生的探針，當與亞鐵(Fe2+)結合時被淬滅。GOT1正常細胞的Calcein-AM染色確定基線熒光，GOT1基因敲除后，細胞熒光分布降低，表明活性鐵池增加（Fig. 5a）。在培養細胞中使用RhoNox-1鐵探針證實了這一觀察（Fig. 5b），在皮下和原位腫瘤中觀察到總鐵水平升高（Fig. 5c）。不穩定鐵的影響在表型上很明顯，在GOT1缺乏的條件下，需要更高濃度的鐵螯合劑DFO來挽救細胞活力（Fig. 5d）。最后，補充檸檬酸鐵銨(FAC)可增強鐵死亡（Fig. 5e, f）。綜上所述，這些數據表明GOT1敲低可促進不穩定鐵，鐵會增強鐵死亡。

GOT1敲低可增強對FINO2（一種藥理性鐵氧化劑）的敏感性。通過下調鐵外流、上調鐵攝取或促進細胞內鐵載體降解，可以改變鐵水平，即鐵蛋白(FTN)或血紅素。為了檢測這些途徑中哪一條導致細胞內鐵增加，首先檢測了鐵運輸蛋白的表達。GOT1敲低不改變鐵運輸蛋白SLC40A1的表達。血紅素加氧酶1 (HMOX1)的表達在Pa-Tu-8902細胞中未發生改變，但在MIA PaCa-2中表達上調。GOT1敲低對NCOA4和轉鐵蛋白受體1影響最小。相比之下，IRP2水平較低，FTN水平較高，這兩種水平在高鐵負荷下均應出現。Pa-Tu-8902細胞的轉錄組和基因集富集分析都揭示了分解途徑的特征通路“溶酶體”和“自噬-溶酶體”。與此一致，GOT1敲除增加了LC3-A/B II/I比值，降低了P62水平，與自噬通量的增加一致（Fig. 5g）。溶酶體抑制劑羥氯喹和Baf-A1說明，GOT1抑制增加自噬通量，而不是延緩自噬過程。

圖5 GOT1抑制促進不穩定鐵釋放

總之，如Fig. 5i所示，抑制GOT1可抑制大量PDA細胞系、原發腫瘤模型和異種移植瘤的生長，同時使一些PDA細胞容易發生鐵死亡。抑制胱氨酸輸入、GSH合成或GPX4可與GOT1協同觸發鐵死亡。這種效應可能是由于氧化還原破壞、線粒體抑制和適應性不穩定鐵釋放的聯合作用，所有這些都是已知的增強鐵死亡的因素。

參考文獻：

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