代謝調節是預防缺血性心臟不良重構的一種有前途的治療方法。但對lncRNA在調節心臟代謝中的作用知之甚少，本文在心肌梗死(MI)小鼠模型中使用無偏轉錄組分析lncRNA表達譜，發現了一種新的心肌細胞豐富的lncRNA，稱為LncHrt，它可以調節導致心力衰竭的代謝和病理生理過程。總之，本文確定LncHrt是一種心臟代謝調節劑，通過調節下游代謝信號通路在維持心臟功能方面發揮重要作用。本文于2021年8月發表在《Basic Research in Cardiology》IF：17.165期刊上。

技術路線：

主要結果：

1、LncHrt是心肌梗死后下調的心肌細胞富集的lncRNA

為了探索心臟疾病中調控病理生理過程的關鍵lncRNA，對心肌梗死(MI)后3和14天的小鼠心臟進行微陣列的轉錄組分析，以sham操作的小鼠做對照組，獲得3天和14天的差異表達lncRNA，并驗證了5個在實驗組最顯著下調的lncRNA的表達（圖1a-e）。 同時，作者在不同組織中檢測了這5個lncRNA的表達，結果發現AK034241和XR_373578是特異性顯著富集于心臟組織，并且AK034241是心臟組織中5個lncRNA里最顯著的（圖1f-h）。因此，作者關注于AK034241并將其命名為lncRNA-heart（LncHrt）。

隨后作者探究了LncHrt在小鼠從出生到成年的心臟組織中的表達模式，結果發現在出乎后第7天表達顯著升高，隨后急劇增加，表明它可能是成年心臟內穩態所需要的，此外，LncHrt同時平均分布在細胞質和細胞核中的，其編碼蛋白的可能性非常低（圖1i-k）。人LncHrt的基因組位點是保守的，而LncHrt序列在多個物種中在外顯子1以及外顯子2的5?端和3?端高度保守（圖1l）。擴張型心肌病患者LncHrt的人同源物的表達也減少（圖1m-n）。以上表明LncHrt可能在調節心臟疾病中發揮重要作用。

圖1 LncHrt是心肌梗死后下調的心肌細胞富集的lncRNA

2、敲除LncHrt損傷心臟內穩態

為了探究LncHrt的功能，實驗AAV9-shRNA敲除新生兒小鼠中的LncHrt，即AAV-LncHrt KD。結果表明敲除LncHrt后，導致心臟擴大，心臟重量與體重之比提高（HW/BW），而不影響體重（圖2a-e）。心電圖顯示LncHrt敲除后小鼠左心室收縮功能受損，縮短分數下降，明顯的左心室擴張和左心室后壁厚度減少（2f-i）。并且這些變化得到了心臟組織學和組織纖維化的結果的支持。與此相反，過表達LncHrt后對小鼠的心臟的影響與上述結果完全相反（圖3）。總之，以上結果表明敲除LncHrt損傷心臟內穩態，過表達LncHrt可保護心臟免受心肌梗死。

圖2 敲除LncHrt損傷心臟內穩態

圖3 AAV9傳遞的LncHrt過表達可保護心臟免受心肌梗死

3、心肌LncHrt過表達挽救心肌梗死的轉錄組

為了探究LncHrt的分子機制，作者對LncHrt過表達的MI發生7天后的心臟組織和對照組進行了基因組RNA測序，鑒定差異表達基因（DEGs）。KEGG分析顯示這些上調的DEGs主要富集到代謝相關通路，如代謝通路、碳代謝、氧化磷酸化、TCA循環、糖酵解、脂肪酸代謝等，下調的DEGs則顯著富集于心臟病理通路，如ECM-受體相互作用和焦點粘連。GO分析也表明上調DEGs顯著富集于代謝過程和心臟肌肉組分，下調DEGs則富集在免疫系統過程和炎癥響應等（圖4a-e），表明LncHrt過表達可能通過介導心臟代謝途徑改善MI發生后的心功能。為了驗證這一假設，對LncHrt過表達的MI發生7天后的心臟組織和對照組進行比較轉錄組分析，得出了與上述研究類似的結果（圖4f-h）。總之，這些結果表明心肌LncHrt過表達挽救心肌梗死的轉錄組通過心臟代謝途徑。

圖4心肌LncHrt過表達挽救心肌梗死的轉錄組

4、LncHrt改善心肌梗死后心臟代謝穩態

通過RNA-seq分析發現LncHrt在MI后調控代謝過程，因而作者思考LncHrt如何在心臟重構和應激反應中緩解心臟代謝應激，改善代謝表型（圖5a）。研究發現，LncHrt敲除導致線粒體的氧通路增強，脂肪酸氧化顯著提高，氧化磷酸化增加，呼吸作用復合體增加（圖5b-f）。這些研究表明心臟LncHrt過表達改善心肌梗死后心臟氧化磷酸化代謝能力。此外，考慮到MI后氧氣供應減少，葡萄糖利用代謝轉變，作者檢測了葡萄糖關鍵酶蛋白HK1，PGK1，和能量代謝酶CS，IDH2的表達。結果顯示，他們的表達在LncHrt過表達后顯著上調（圖5g-h）。此外，LncHrt過表達也顯著增加了ATP水平（圖5i）。而敲除LncHrt則導致線粒體氧代謝的指標顯著下降（圖5j-m）。總之，這些結果表明LncHrt能保持心肌代謝穩態，改善心肌梗死后的心功能。

圖5 LncHrt改善心肌梗死后心臟代謝穩態

5、LncHrt通過與SIRT2相互作用激活LKB1-AMPK信號通路

為了闡明LncHrt在MI反應中調節心肌代謝穩態的分子機制，首先探究LncHrt是否可能調節其鄰近基因Klhl33的表達，但是過表達LncHrt對其體內外的表達沒有影響，于是作者探究了其相互作用的蛋白。質譜和pull-down聯合分析初步鎖定了LncHrt與SIRT2的相互作用關系（圖6a-c）。反過來，LncHrt也在SIRT2的免疫磁珠中顯著富集（圖6d-e）。表明LncHrt與SIRT2的相互作用。

然后研究這種相互作用的功能相關性。先前的研究表明，SIRT2使下游激酶LKB1去乙酰化，促進LKB1的磷酸化，隨后激活LKB1-AMPK信號通路。這一途徑通過保存肥大心臟中AMPK的活性來保護心臟。研究發現LncHrt過表達促進LKB1磷酸化，從而導致下游的激酶AMPK在Thr172位點磷酸化（圖6f-g），相反LncHrt敲除減少LKB1和AMPK的磷酸化抑制LKB1-AMPK信號（與6h-i）。這些數據是由基因集富集分析LncHrt過表達的心臟RNA-seq數據支持，LKB1-AMPK通路對mTOR的能量依賴性調節被富集(圖6j)。綜上所述，這些研究表明LncHrt與SIRT2相互作用，通過調節梗死心臟中LKB1-AMPK信號通路來調節其功能。

圖6 LncHrt通過與SIRT2相互作用激活LKB1-AMPK信號通路

6、LncHrt通過阻斷CDK5對SIRT2的抑制來維持SIRT2活性

由于LncHrt保留了SIRT2的活性并促進了下游激酶的活性，進一步探究LncHrt如何影響SIRT2上游信號以正向調節其活性。研究發現LncHrt不影響Sirt2轉錄水平或蛋白表達，因為在LncHrt功能獲得或功能喪失模型中中Sirt2沒有改變（圖7a-e）。鑒于此前一項研究揭示p35-Cdk5在有絲分裂后細胞中通過S331磷酸化抑制SIRT2催化活性的翻譯后機制。作者推測CDK5轉錄后調節SIRT2，并抑制了LKB1-AMPK活性。作者發現LncHrt下調促進了CDK5和SIRT2之間的相互作用，隨后，提高了LKB1的賴氨酸乙酰化，導致LKB1活性及其下游信號級聯的破壞（圖7f-i）。這一觀察結果排除了LncHrt直接調節CDK5表達的想法。

最后，探究CDK5耗盡是否會調節心肌細胞中LKB1-AMPK信號下游的SIRT2。結果發現敲除CDK5會提高LKB1-AMPK信號，但是SIRT2抑制顯著阻斷了LKB1-AMPK信號的激活（圖7j-k）。因此， CDK5通過調節SIRT2活性介導LKB1-AMPK信號通路。LncHrt表現出心臟代謝保護，至少部分是通過干擾SIRT2的催化活性，導致LKB1-AMPK信號激活。

圖7 LncHrt通過阻斷CDK5對SIRT2的抑制來維持SIRT2活性

7、LncHrt對梗死心臟的治療潛力

在證明LncHrt可以保護心臟免受心肌梗死損傷后，接下來探討LncHrt是否可以作為治療梗死心臟的潛在治療靶點。MI后向心肌內注射AAV9-LncHrt或AAV9-CTRL，并持續監測LncHrt的表達，直至其在兩組間表現出顯著差異。結果發現，LncHrt敲除后改善了心臟的形態，顯著降低了HW/BW比值（圖8a-b）。注射2周后，LncHrt敲除改善了心臟功能，表現為縮短分數增加，心室內經減小（圖8c-e）。組織學也表明LncHrt敲除后心臟組織的病理性變化顯著減少（圖8f-j）。此外，敲除LncHrt后心臟代謝內穩態也得到恢復，表現在氧通量，呼吸作用和ATP等（圖8k-o）。總之，這些表明LncHrt對梗死心臟的有治療潛力。

圖8 LncHrt對梗死心臟的治療潛力

本文鑒定了一種名為LncHrt的新型心肌細胞富集的lncRNA，它作為心臟代謝的重要調節因子發揮作用。LncHrt是MI反應中下調最多的lncRNA，對心臟穩態至關重要，因為LncHrt的耗竭會損害心臟形態、代謝和功能。重要的是，心臟特異性過表達LncHrt通過表達參與代謝信號和肌肉收縮的基因保護MI后的心臟。LncHrt過表達，心臟中轉錄組的改變補償了MI誘導的代謝信號的失調。此外，lncRNA與代謝偶聯的機制是通過SIRT2-LKB1-AMPK軸介導的，這為lncRNA可以影響代謝信號級聯提供了證據（圖9）。總之，該研究確定LncHrt是一種新型的心臟lncRNA，并揭示了lncRNA在病理應激后維持心臟代謝穩態中未被認識的作用。

圖9 LncHrt在心肌梗死中的作用機制的工作模型

參考文獻：

Liu Ning., Kataoka Masaharu., Wang Yingchao., Pu Linbin., Dong Xiaoxuan., Fu Xuyang., Zhang Feng., Gao Feng., Liang Tian., Pei Jianqiu., Xiao Changchen., Qiu Qiongzi., Hong Tingting., Chen Qiming., Zhao Jing., Zhu Lianlian., He Junhua., Hu Xiaoyun., Nie Yu., Zhu Wei., Yu Hong., Cowan Douglas B., Hu Xinyang., Wang Jian'an., Wang Da-Zhi., Chen Jinghai.(2021). LncRNA LncHrt preserves cardiac metabolic homeostasis and heart function by modulating the LKB1-AMPK signaling pathway. Basic Res Cardiol, 116(1), 48. doi:10.1007/s00395-021-00887-3