結(jié)腸癌(CRC)是世界上第三常見的癌癥，也是癌癥相關(guān)死亡的主要原因。癌細(xì)胞迅速擴(kuò)張，所有實(shí)體瘤由于血管化不足而經(jīng)歷缺氧。缺氧是實(shí)體腫瘤的一個(gè)標(biāo)志，它促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、生存和轉(zhuǎn)移，并對(duì)化療和放療產(chǎn)生耐藥性。缺氧反應(yīng)主要由轉(zhuǎn)錄因子缺氧誘導(dǎo)因子1α (HIF-1α)和HIF-2α介導(dǎo)，而HIF-1α和HIF-2α在CRC中表現(xiàn)出不同的作用。我們的研究表明，癌癥細(xì)胞依賴于HIF-2α的一種機(jī)制脆弱性，可用于CRC治療。該研究2021年6月發(fā)表在《JOURNAL OF CLINICAL INVESTIGATION》，IF為14.808。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1. 藥物篩選確定腫瘤類腸道中HIF-2α的合成易損性

作者構(gòu)建Apc缺失型（Cdx2-ERT2Cre；Apc^fl/^fl）和CRC HIF-2α過表達(dá)小鼠模型（Cdx2-ERT2^Cre；Apc^fl/^fl HIF-2α^LSL/^LSL），從這2個(gè)小鼠模型中分離腸類藥物，并用化療藥物培養(yǎng)，生長(zhǎng)被監(jiān)測(cè)了5天(圖1A)。在Cdx2-ERT2^Cre;在Apc^fl/^fl HIF-2α^LSL/^LSL小鼠中，他莫昔芬可誘導(dǎo)HIF-2α，并特異性地破壞結(jié)腸上皮細(xì)胞中的Apc。來自Cdx2-ERT2Cre；Apc^fl/^fl腫瘤腸系膜的小鼠對(duì)doxorubicin, mitoxantrone, irinotecan,以及 eribulin等藥物高度敏感，與來自Cdx2-ERT2^Cre；Apc^fl/^fl HIF2α^LSL/^LSL的不同（圖1B）。RSL3、sorafenib索拉菲尼、erastin和DMF被認(rèn)為是最有效的小分子，可以顯著降低Cdx2-ERT2^Cre；Apc^fl/^fl HIF2α^LSL/^LSL腫瘤腸道類物質(zhì)的生長(zhǎng)（圖1C）。Erastin和RSL3是經(jīng)典的ferroptosis激活劑，分別抑制xCT(由Slc7a11基因編碼，是xC系統(tǒng)的一個(gè)組成部分)和GPX4。DMF一種細(xì)胞可滲透的線粒體衍生物，在一些癌癥細(xì)胞系中具有細(xì)胞毒性（圖1D）這些結(jié)果表明，HIF-2α表達(dá)的腫瘤可以被氧化應(yīng)激激活劑選擇性靶向。

圖1 篩選能抑制過表達(dá)HIF-2α的腫瘤腸樣細(xì)胞生長(zhǎng)的化合物

2. 在CRC細(xì)胞中，HIF活化與鐵死亡的激活劑協(xié)同作用

Erastin和RSL3是經(jīng)典的鐵死亡誘導(dǎo)劑，作者已證明，缺氧模擬FG4592或缺氧顯著增強(qiáng)了鐵死亡誘導(dǎo)物erastin和RSL3以HIF-2α依賴的方式處理后的細(xì)胞死亡。作者在最后一次給藥后14天，分析這些小鼠的結(jié)腸組織的組織學(xué)變化(圖2A)。Slc7a11的缺失或HIF-2α的過度表達(dá)與對(duì)照動(dòng)物的情況無法區(qū)分（圖2B）。然而，Slc7a11的破壞與HIF-2α過表達(dá)聯(lián)合導(dǎo)致結(jié)腸上皮變性和空泡化(圖2B)。通過4-羥基2-壬烯醛(4-HNE)染色測(cè)定脂質(zhì)過氧化誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激(圖2C)。與對(duì)照組相比，Villin-CreER^T2Slc7a11^fl / ^fl; HIF-2α^LSL/^LSL小鼠的組織學(xué)評(píng)分(圖2D)和4-HNE強(qiáng)度(圖2E)均顯著增加，表明這些小鼠氧化應(yīng)激和上皮細(xì)胞損失增加。此外，與對(duì)照組比較，Villin-CreER^T2-HIF-2α^LSL/^LSL小鼠的HILPDA和PLIN2 mRNA水平顯著升高(圖2F)。與對(duì)照組相比，Villin-CreER^T2-HIF-2α^LSL/^LSL小鼠肝臟和腸道鐵水平都更高(圖2G)。肝臟鐵含量的增加是由于小腸對(duì)鐵的吸收增加。這些數(shù)據(jù)證實(shí)了HIF-2α在體內(nèi)對(duì)鐵死亡敏感的作用，并提示誘導(dǎo)鐵死亡的藥物可能對(duì)缺氧細(xì)胞有很高的殺傷效果。

圖2. HIF-2α激活可增強(qiáng)體內(nèi)鐵死亡

3. HIF激活可促進(jìn)DMF誘導(dǎo)的CRC細(xì)胞死亡

作者的篩選鑒定出DMF是一種小分子，可以有效地減少低氧腫瘤腸道樣體的生長(zhǎng)（圖1C）。一組CRC細(xì)胞系使用DMF單獨(dú)或聯(lián)合缺氧或模擬缺氧FG4592處理。通過MTT和長(zhǎng)期克隆生存試驗(yàn)評(píng)估，FG4592增強(qiáng)DMF誘導(dǎo)的CRC細(xì)胞死亡(圖3,A- C)。此外，DMF處理和缺氧培養(yǎng)的細(xì)胞存活率較低(圖3,D和E)。與erastin和RSL3數(shù)據(jù)一致，HIF-2α是促進(jìn)DMF介導(dǎo)的CRC細(xì)胞生長(zhǎng)的關(guān)鍵(圖3F)。

圖3. 缺氧模擬有助于DMF誘導(dǎo)的CRC細(xì)胞生長(zhǎng)抑制

4. DMF獨(dú)立于鐵死亡誘導(dǎo)細(xì)胞死亡

由于DMF與其他細(xì)胞對(duì)鐵死亡激活劑一起有效地降低了缺氧細(xì)胞的生長(zhǎng)(圖1C)，我們?cè)u(píng)估了DMF是否介導(dǎo)了鐵死亡激活劑的死亡。在DMF處理后，Fer-1和Lip-1不能挽救細(xì)胞的死亡和活力，而rsl3介導(dǎo)的細(xì)胞死亡被Fer-1和Lip-1挽救(圖4A)。在DMF處理后，Fer-1和Lip-1不能挽救細(xì)胞的死亡和活力，而RSL3介導(dǎo)的細(xì)胞死亡被Fer-1和Lip-1挽救(圖4A)。DMF可與抗氧化劑GSH直接反應(yīng)，導(dǎo)致NADPH降低，ROS增強(qiáng)。然而，FG4592和糖酵解抑制劑的共同作用并沒有降低細(xì)胞活力(圖4E)。這些結(jié)果表明，在DMF介導(dǎo)的缺氧腫瘤細(xì)胞死亡中有其他機(jī)制參與。

圖4. DMF在CRC細(xì)胞中不是鐵轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)物。

5. 在DMF誘導(dǎo)的HIF-2α介導(dǎo)的細(xì)胞死亡中，活性氧積累和鐵毒性是必不可少的

添加半胱氨酸前體n -乙酰半胱氨酸(NAC)的生長(zhǎng)培養(yǎng)基挽救了含或不含FG4592 DMF處理的HCT116和SW480細(xì)胞的死亡和活力(圖5A和補(bǔ)充圖9C)。在DMF處理和維持缺氧的細(xì)胞中也觀察到類似的結(jié)果(圖5B)。FG4592或單獨(dú)的缺氧處理增加了ROS，這是通過細(xì)胞滲透的2,7 -二氯二氫熒光素二醋酸酯(H2DCFDA)評(píng)估的，它被用作ROS的指標(biāo)(圖5,C和D)。與DMF的協(xié)同處理增強(qiáng)了ROS生成的增加，而NAC可以挽救ROS生成(圖5,C和D)。為了證實(shí)對(duì)氧化細(xì)胞死亡的敏感性是由HIF-2α介導(dǎo)的，利用了shRNA介導(dǎo)的HIF-1α和HIF-2α敲低細(xì)胞。HIF-2α敲低細(xì)胞中的ROS水平顯著降低(圖5E)，表明DMF處理后HIF-2α在ROS產(chǎn)生中的作用。

由于HIF激活會(huì)導(dǎo)致線粒體代謝的變化和ROS的產(chǎn)生，作者分析了DMF或FG4592處理是否會(huì)引起線粒體代謝物池的變化。然而，線粒體代謝物水平未見顯著變化，表明HIF-2α通過其他機(jī)制影響細(xì)胞ROS(圖5F)。由DMF和FG4592介導(dǎo)的細(xì)胞死亡在低鐵和對(duì)照培養(yǎng)基中被挽救(圖5G)。總之，這些數(shù)據(jù)表明，鐵毒性通過HIF-2α和氧化應(yīng)激脆弱性的機(jī)制。

圖5. 活性氧的產(chǎn)生和鐵的積累參與DMF和FG4592介導(dǎo)的CRC細(xì)胞死亡

6. H₂S的保護(hù)性過硫化作用可以挽救DMF和HIF-2α誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡

接下來，評(píng)估了不可逆的蛋白質(zhì)氧化是否參與了DMF和FG4592誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。H₂S可通過過硫化作用(翻譯后修飾)防止半胱氨酸硫醇的過度氧化(圖6A) 為了排除H₂S的保護(hù)作用不是由于DMF上的硫化物陰離子親核添加導(dǎo)致的DMF消耗，在DMF和FG4592或DMF和缺氧導(dǎo)致細(xì)胞死亡16小時(shí)后，將Na₂S和3-MP添加到新鮮培養(yǎng)基中（圖6B）。即使在這些條件下，Na₂S和3-MP也能防止細(xì)胞死亡(圖6,C和D)。此外，補(bǔ)充3-MP和Na₂S后，DMF或DMF和FG4592誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS水平降低(圖6E)。這些數(shù)據(jù)與模型一致，即DMF增強(qiáng)HIF誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡涉及氧化蛋白損傷，而氧化蛋白損傷受到H₂S的保護(hù)。

圖6. H₂S可防止不可逆的蛋白質(zhì)氧化，挽救DMF和FG4592介導(dǎo)的細(xì)胞死亡

7. FG4592增強(qiáng)DMF介導(dǎo)的體內(nèi)CRC細(xì)胞死亡

接下來，作者評(píng)估了DMF和FG4592聯(lián)合治療已建立的CRC腫瘤的體內(nèi)療效。此，HCT116、SW480和DLD1細(xì)胞被皮下植入免疫缺陷小鼠的側(cè)壁，并在DMF和FG4592治療前建立10天(圖7A)。從與接受對(duì)照或單獨(dú)藥物治療的患者相比，在所有3個(gè)異種移植中，DMF和FG4592治療的腫瘤體積(圖7B)和腫瘤重量(圖7C)均顯著減少。通過BrdU摻入試驗(yàn)評(píng)估的腫瘤細(xì)胞增殖在DMF和FG4592聯(lián)合處理的HCT116、SW480和DLD1異種移植中也降低了(圖7D)。然而，在與DMF和FG4592共同處理的所有3個(gè)異種移植物中，tunel陽(yáng)性凋亡細(xì)胞的百分比都有所增加(圖7E)。總之，這些數(shù)據(jù)表明，缺氧腫瘤細(xì)胞對(duì)DMF治療非常脆弱，突出了一個(gè)潛在的治療窗口。

圖7. DMF和FG4592增強(qiáng)體內(nèi)CRC細(xì)胞死亡

8. DMF介導(dǎo)的體內(nèi)CRC細(xì)胞死亡依賴于HIF-2α

為了證實(shí)HIF-2α在DMF介導(dǎo)的體內(nèi)CRC細(xì)胞死亡中的作用，利用HIF-2α敲低HCT116細(xì)胞。在DMF和FG4592治療前，將穩(wěn)定的非靶標(biāo)擾亂和HIF-2α敲低的HCT116細(xì)胞皮下注射到免疫受損小鼠的兩側(cè)，并允許其生長(zhǎng)10天(圖8A)。HIF-2α基因敲低的細(xì)胞對(duì)DMF和FG4592處理具有抗性。在DMF+FG4592處理的小鼠中，表達(dá)雜亂shRNA的細(xì)胞顯示腫瘤體積和重量顯著減少，而HIF-2α敲低的細(xì)胞則完全耐受(圖8,B和C)。同樣，在DMF+FG4592處理后，HIF-2α敲低細(xì)胞的腫瘤增殖和凋亡沒有改變(圖8,D和E)。這些數(shù)據(jù)表明，HIF-2α激活增加了體內(nèi)氧化細(xì)胞死亡的脆弱性。

圖8. DMF介導(dǎo)的體內(nèi)CRC細(xì)胞死亡依賴于HIF-2α

總結(jié)：

該研究揭示了HIF-2α在驅(qū)動(dòng)低氧CRC細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)化合物(如DMF)的合成致命性方面的作用，并揭示了利用這種內(nèi)在脆弱性進(jìn)行化療發(fā)展的潛力。