胰腺導管腺癌(PDAC)是最致命的癌癥之一。缺乏有效的治療和PDAC發病率的增加促使人們對PDAC進展有更深入的了解。2021年7月發表于Molecular Therapy: Nucleic Acids（IF=8.886）的文章“LINC00941 promotes glycolysis in pancreatic cancer by modulating the Hippo pathway”報道了LINC00941通過調節Hippo途徑促進胰腺癌糖酵解。通過分析lncRNA數據集，我們發現LINC00941表達增加導致PDAC患者預后不良。此外，體外和體內實驗表明LINC00941通過促進有氧糖酵解促進PDAC癌細胞生長。在機理上，LINC00941被發現與MST1相互作用，促進PP2A介導的MST1去磷酸化，導致Hippo途徑激活，從而增強PDAC的糖酵解。這些結果表明LINC00941在PDAC腫瘤發生中發揮了關鍵作用，可能是PDAC治療的新途徑。

技術路線

結果

1）PDAC中LINC00941表達增加與疾病進展和預后不良呈正相關

我們比較了lncRNA在胰腺癌和配對的相鄰非腫瘤胰腺組織樣本中的表達，發現與非轉化胰腺組織相比，有34個lncRNAs顯著上調，32個lncRNAs在胰腺癌組織中表達下調(圖1A)。接下來，我們分析了前兩個上調的lncRNAs-LINC00941和LINC01234與TCGA數據集的臨床結果的相關性。Kaplan-Meier分析結果顯示，LINC01234對胰腺癌患者的總生存期無預測價值，而LINC00941與胰腺癌患者的不良預后顯著相關(圖1B)。與GEO的數據集一致，我們發現LINC00941在PDAC TCGA數據集中與正常胰腺GTEx數據集相比高表達(圖1C和1D)。為了驗證芯片數據，我們采用real-time PCR檢測了10例配對胰腺癌及癌旁組織中LINC00941的表達。我們發現LINC00941在PDAC組織中表達顯著增加(圖1E)。此外，我們通過原位雜交(ISH)驗證了LINC00941在石蠟包埋的胰腺癌和癌旁組織中的表達。結果顯示，LINC00941主要定位于PDAC細胞質，且LINC00941在胰腺癌組織中的表達高于癌旁組織(圖1F)。接下來，我們評估TCGA數據集中LINC00941表達與不同臨床病理特征的相關性。我們發現LINC00941的表達與腫瘤大小和腫瘤分期呈正相關(圖1G)。與TCGA隊列研究結果一致，在PDAC患者中，LINC00941高水平表達與縮短生存時間顯著相關。

2）LINC00941體外抑制PDAC癌細胞生長

為了揭示LINC00941在胰腺癌進展中的作用，我們在兩個高表達LINC00941的PDAC癌細胞系PANC-1和SW1990中沉默LINC00941的表達(圖2A)。LINC00941的shRNA顯著抑制了LINC00941在PDAC細胞株中的表達(圖2B)。細胞活力測定顯示LINC00941的缺失極大地抑制了PANC-1和SW1990細胞的增殖(圖2C)。相比之下，LINC00941過表達顯著促進了兩種LINC00941表達相對較低的PDAC癌細胞BxPC-3和CFPAC-1的生長(圖2D)。集落形成實驗表明，LINC00941的敲除顯著抑制了PDAC癌細胞的集落形成能力(圖2E)。為了進一步模擬體內生長條件，采用三維生長實驗比較LINC00941沉默的PDAC細胞與對照細胞的生長能力。與2D培養一致，LINC00941的缺失顯著抑制了PDAC細胞株的球形生長(圖2F)。總的來說，這些數據表明，抑制LINC00941會損害PDAC癌細胞的生長。

3）LINC00941耗盡抑制PDAC細胞的糖酵解

我們旨在闡明LINC00941調控PDAC癌細胞生長的機制。我們觀察到當在新鮮培養基中培養12小時至相同的濃度時，對照PDAC細胞培養基中的酚紅呈現出由紅色逐漸變為黃色的顏色轉變，而LINC00941-沉默的腫瘤細胞株則沒有這種顏色轉變(圖3A)。這些結果表明LINC00941抑制了細胞外酸性的產生。通過對細胞外pH值的測量證實，來自對照腫瘤細胞的培養基逐漸變得酸性更強，而來自LINC00941沉默的腫瘤細胞株的培養基并沒有像來自對照細胞的培養基那樣很快變得酸性(圖3B)。LINC00941基因的下調顯著抑制了PANC-1和SW1990細胞的糖酵解能力(圖3C和3D)。因此，我們測量了糖酵解途徑中酶的mRNA表達水平。我們發現，沉默LINC00941后，葡萄糖轉運體1(GLUT1)、己糖激酶2 (HK2)、PFKFB3和乳酸脫氫酶A (LDHA) mRNA的表達顯著降低(圖3E和3F)。此外，我們比較了LINC00941 sh陰性對照(shNC)、sh1和sh2 PDAC細胞的葡萄糖攝取和乳酸生成。正如預期的那樣，LINC00941基因的下調顯著抑制了PDAC癌細胞的葡萄糖攝取和乳酸生成(圖3G和3H)。綜上所述，這些數據表明LINC00941的缺失抑制了PDAC細胞中的糖酵解。

4）糖酵解是LINC00941介導的生長促進所必需的

我們旨在評估增強的糖酵解對于LINC00941介導的PDAC細胞的生長促進作用是否必要。。細胞增殖實驗結果顯示，2-DG極大地破壞了LINC00941過表達誘導的BxPC-3和CFPAC-1細胞的生長促進作用(圖4A和4 B)。為了進一步證實這一點，將培養基中的葡萄糖替換為半乳糖以抑制糖酵解。如預期的那樣，在半乳糖替代后乳酸產量顯著降低。與此同時，異位表達LINC00941的BxPC-3和CFPAC-1細胞的增殖急劇下降(圖4C和4D)。進一步研究發現，LINC00941高表達組比LINC00941低表達組有更高的最大標準化攝取值(SUVmax)值，GLUT1、HK2、PFKFB3、LDHA染色更強(圖4E，4G)。總的來說，這些數據表明，糖酵解對于LINC00941介導的生長促進作用是必要的。

5）LINC00941激活Hippo通路，增強PDAC細胞的糖酵解

我們旨在揭示LINC00941增強PDAC細胞糖酵解的信號通路。我們發現轉染LINC00941顯著提高了PANC-1細胞中TEAD1的轉錄活性(圖5A)，提示Hippo途徑可能介導了LINC00941對糖酵解的調控。因此，我們檢測了Hippo途徑下游三個典型基因CTGF、CYR61和ANKRD1的表達。結果顯示，LINC00941基因敲除顯著降低了這三個靶基因在PANC-1和SW1990 PDAC細胞中的mRNA表達水平(圖5B)。為了進一步證實這一點，我們通過免疫熒光染色檢測了YAP1在對照和LINC00941沉默的PDAC細胞中的亞細胞位置。我們發現，在LINC00941 sh1和sh2 pan -1細胞中，YAP1核定位的比例遠高于對照細胞(圖5C和5D)。接下來，用免疫印跡法檢測LINC00941沉默的PDAC細胞株中Hippo通路的改變。結果顯示，與對照細胞相比，LINC00941敲低細胞中MST1、LATS1和YAP1的磷酸化水平明顯上調(圖5E)。為了進一步確定LINC00941在PDAC中的致癌作用是否需要YAP1，將兩個YAP1突變體引入LINC00941過表達或LINC00941缺失的PDAC細胞中。正如預期的那樣，組成型激活的YAP1 (S127A)的異位表達逆轉了LINC00941耗盡的PDAC細胞的生長受損(圖5F)。同樣，Hippo途徑的抑制劑verteporfin也會阻礙LINC00941過表達細胞的生長(圖5G)。此外，ECAR測量結果顯示，YAP1 (S127A)過表達恢復了LINC00941耗盡PDAC細胞中受損的糖酵解，YAP1 (S94A)過表達阻礙了LINC00941過表達介導的糖酵解增強(圖5H)。因此，我們假設YAP1可以轉化糖酵解酶的表達。實時PCR結果顯示，YAP1 S127A突變體在LINC00941敲低PDAC細胞中可以逆轉GLUT1、HK2、PFKFB3和LDHA的表達，而YAP1 S94A突變體則不能(圖5I)。此外，ChIP-PCR結果顯示YAP1可以直接結合GLUT1、HK2、PFKFB3和LDHA基因的啟動子。綜上所述，這些數據表明Hippo途徑是LINC00941誘導糖酵解增強的中介。

6）LINC00941促進PP2A介導的MST1去磷酸化，觸發Hippo通路

為了闡明LINC00941激活Hippo通路的機制，我們首先確定了LINC00941在PDAC細胞中的亞細胞定位。ISH染色結果顯示LINC00941主要定位于PDAC細胞的胞質(圖6A)。此外，通過LINC00941 RNA下拉和質譜分析，篩選與LINC00941相互作用的潛在蛋白(圖6B)。結果表明，Hippo途徑的關鍵節點之一MST1可以與LINC00941互作。免疫印跡數據顯示LINC00941可與MST1相互作用(圖6C)。為了進一步證實這種相互作用，我們對PANC-1細胞株進行了RIP實驗。如圖6D和6E所示，凝膠電泳和qPCR均能在MST1沉淀中檢測到LINC00941，而在免疫球蛋白G (IgG)沉淀中檢測不到LINC00941(圖6D和6E)。為了明確LINC00941和MST1相互作用的確切區域，我們構建了一系列截斷的LINC00941變體。LINC00941的800到1500核苷酸被發現與MST1結合(圖6F)。競爭性RNA下拉實驗及MST1和LINC00941免疫熒光染色進一步證實LINC00941與MST1相互作用(圖6G和6H)。coIP結果顯示，在LINC00941沉默的細胞中，MST1和PP2A之間的相互作用比對照細胞弱(圖6I)。此外，PP2A沉默抵消了BXPC-3和CFPAC-1細胞中增強的糖酵解和促生長作用(圖6J, 6K)。綜上所述，這些結果表明LINC00941促進PP2A介導的MST1去磷酸化，從而觸發Hippo通路。

7）靶向LINC00941可阻礙PDAC在體內的進展

我們評估LINC00941缺失是否在體內干擾PDAC的形成。結果顯示，注射對照細胞的小鼠比注射LINC00941敲除細胞的小鼠發生了更大的腫瘤(圖7A)。腫瘤體積的統計分析(Vs)表明，來自對照細胞的皮下移植瘤比來自shLINC00941細胞的移植瘤發育得更快(圖7B)。注射shLINC00941細胞的小鼠的腫瘤負荷低于對照組注射細胞的小鼠(圖7C)。免疫組化(IHC)染色分析顯示，來自shLINC00941細胞的腫瘤比來自shNC細胞的腫瘤表現出更弱的PCNA、YAP1、GLUT1、HK2和LDHA染色(圖7D)。體內成像系統(IVIS)結果顯示，LINC00941的缺失降低了PDAC細胞的侵襲性(圖7E)，延長了異種移植小鼠的總存活率(圖7F)。為確定與一線藥物的潛在協同作用，給予吉西他濱(50 mg/kg)。結果顯示，與單獨使用LINC00941缺失或吉西他濱治療的小鼠相比，使用shLINC00941聯合吉西他濱治療的小鼠腫瘤更小，總生存期更長(圖7F)。與LINC00941缺失組或吉西他濱單獨處理組相比，shLINC00941 +吉西他濱組小鼠的切片顯示出較弱的PCNA, YAP1, GLUT1, HK2和LDHA染色(圖7G)。因此，LINC00941的缺失降低了腫瘤負擔，并減弱了PDAC在體內的進展。

   結論：我們的研究發現，在PDAC中LINC00941高表達與預后不良呈正相關。功能喪失和功能獲得實驗表明LINC00941促進PDAC癌細胞的生長和糖酵解。機理研究表明LINC00941通過促進MST1去磷酸化促進YAP1核定位和下游糖酵解相關基因表達。此外，體內研究表明LINC00941缺失可抑制PDAC的進展。