由異常細胞周期進程驅動的不受控細胞增殖是癌癥最重要的標志之一。因此，尋求藥物來阻滯細胞周期和停止細胞增殖是癌癥治療的一種合理方式。細胞周期受細胞周期蛋白依賴性激酶（CDKs）及其伴侶細胞周期蛋白的精確調控。從而使S期進入和DNA復制成為可能。使用CDK4/6抑制劑（CDK4/6i）靶向CDK4和CDK6將細胞周期阻滯在G1期，并阻礙細胞增殖。三種CDK4/6抑制劑延長了晚期激素受體陽性和人表皮生長因子受體2陰性乳腺癌患者的無進展生存期和總生存期。因此，CDK4/6抑制劑聯合內分泌治療已成為這類乳腺癌的標準治療方案。然而，對CDK4/6抑制劑的耐藥不可避免，超過70%的患者在12~36個月內發生疾病進展，這帶來了巨大的臨床挑戰。CDK4/6i耐藥的主要機制包括上游致癌信號的異常激活和關鍵細胞周期調節因子的改變。由CCNE1基因編碼的細胞周期蛋白E1激活CDK2并促進細胞周期進展。cyclin E1的高表達不僅預示著乳腺癌患者的不良預后，而且在臨床前模型中還促進了對內分泌治療和CDK4/6抑制劑的耐藥。cyclin E1蛋白可能在CDK4/6i耐藥中起關鍵作用，直接靶向cyclin E1蛋白可能是克服CDK4/6i耐藥的有效途徑。之前的研究發現lncRNA DILA1通過穩定cyclin D1蛋白促進乳腺癌他莫昔芬耐藥，揭示了lncRNA在細胞周期調控中的作用。然而，lncRNA在CDK4/6i耐藥中的作用仍不清楚。該研究發表在《Science Advances》，IF：13.6。
技術路線

主要研究結果
1. Cyclin E1失調促進乳腺癌細胞對CDK4/6抑制劑的耐藥
       建立CDK4/6i耐藥乳腺癌細胞（MCF7-palR和T47D-palR細胞）。為了探索cyclin E1在CDK4/6i耐藥細胞中的作用，研究者首先評估了其在耐藥細胞及其親本細胞中的mRNA和蛋白水平。研究者發現，在MCF7-palR和T47D-palR細胞中，cyclin E1的蛋白水平上調，而其mRNA水平保持不變（圖1A）。此外，細胞周期蛋白E1蛋白在耐藥細胞中比在其親本細胞中更穩定（圖1B）。這些結果表明，細胞周期蛋白E1在翻譯后水平失調。為了確定細胞周期蛋白E1表達增加是否有助于CDK4/6i耐藥，研究者在耐藥乳腺癌細胞中使用特異性小干擾RNA（siRNA）沉默細胞周期蛋白E1，并利用甲基噻唑基二苯基四唑溴鹽試驗評估其對哌柏西利的敏感性。正如預期，研究者發現，細胞周期蛋白E1敲低恢復了MCF7-palR和T47D-palR細胞對哌柏西利的敏感性（圖1C）。這些結果表明，細胞周期蛋白E1蛋白的失調是導致CDK4/6i抵抗的原因。

圖1 CDK4/6i耐藥的乳腺癌細胞表達更高水平的cyclin E1蛋白和cyclin E1相互作用的lncRNA EILA

2. EILA是與細胞周期蛋白e1相互作用的長鏈非編碼RNA
       為了鑒定可能與cyclin E1蛋白相互作用并促進CDK4/6i耐藥的lncRNA，研究者進行了兩個高通量lncRNA測序。用血凝素（HA）抗體進行RNA免疫沉淀（RIP）實驗，將穩定表達HA標記的cyclin E1的MCF7-pa細胞中的RNA進行測序。以免疫球蛋白G作為對照，研究者鑒定了52個與細胞周期蛋白e1相互作用的lncRNA。此外，研究者從MCF7-pa和MCF7-palR細胞中提取RNA進行lncRNA測序。共鑒定出829個在MCF7-palR細胞中上調的lncRNA，這些lncRNA可能在促進CDK4/6i耐藥中發揮作用。在這些lncRNA中，5個lncRNA（AC093297、LINC00664、PVT1、NRSN2-AS1和SNHG17）在兩種測序中均被富集，使其成為進一步研究的候選lncRNA（圖1D）。為了驗證序列數據，研究者進行了實時定量反轉錄聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測，發現MCF7-palR細胞中AC093297、LINC00664和SNHG17的表達水平顯著高于其親本細胞（圖1E）。
       為了進一步研究EILA的生物學特性，研究者首先測定了其在耐藥細胞及其親本細胞中的RNA水平。然后研究者通過qRT-PCR分析細胞質和細胞核部分來探索EILA的亞細胞定位，發現它大部分位于細胞核（超過70%），少數位于細胞質（約20%）（圖1F）。與這些結果一致，RNAscope原位雜交(ISH)也證實了EILA主要定位于細胞核，并且在耐藥細胞中表達上調（圖1G）。RIP、qRT-PCR和RNA pull-down實驗以及蛋白質印跡表明，EILA可以直接與細胞周期蛋白E1相互作用（圖1H，I）。這一發現被標記的重組細胞周期蛋白E1進一步驗證（圖1J）。此外，研究者對EILA進行了RNA熒光原位雜交（FISH）檢測，隨后對cyclin E1進行了免疫熒光檢測，證實了它們在MCF7-palR和T47d-palR細胞核中的共定位（圖1K）?？傊?，這些結果表明，EILA與cyclin E1在細胞核內直接相互作用，這可能在CDK4/6抑制劑耐藥中起重要作用。
3. EILA參與細胞周期調控并與乳腺癌不良預后相關
       為了評估EILA在乳腺癌中的臨床意義，研究者分析了癌癥基因組圖譜乳腺浸潤性癌數據庫中109對配對的正常和腫瘤組織的RNA測序數據（圖2A）。結果表明，EILA在腫瘤組織中的表達顯著高于正常組織。此外，qRT-PCR分析了47對來自中山大學孫逸夫紀念醫院的正常和腫瘤組織（SYSMH隊列1，n=47），結果也顯示EILA在腫瘤組織中表達上調（圖2B）。這些發現被RNA ISH進一步證實，表明EILA在乳腺癌中異常表達（圖2C）。為了評估EILA的預后價值，研究者分析了bc-GenExMiner v4.7數據庫中的乳腺癌轉錄組數據。EILA高表達與較短的無病生存期（DFS）相關（圖2D）。在亞組分析中，EILA高表達預示雌激素受體陽性（ER）乳腺癌患者預后較差，但在雌激素受體陰性（ER+?）乳腺癌患者中無上述情況，提示其可能作為ER乳腺癌的生物標志物（圖2D）。與在線數據庫的結果一致，研究者在一個獨立隊列（SYSMH隊列2，n=215）中證實，在ER/HER2+ -乳腺癌患者中，EILA高表達與較差的臨床結局相關（圖2E）。單變量和多變量Cox比例風險回歸分析顯示，只有EILA和細胞周期蛋白E1的表達是ER/HER2+ -乳腺癌預后的獨立預測因素?？傊@些結果表明EILA和cyclin E1蛋白都是預測乳腺癌預后的潛在生物標志物。
       Rb是一個腫瘤抑制因子，在細胞周期從G1期到S期的轉變過程中被磷酸化，而Ki67是癌細胞的增殖標記物。通過免疫組織化學染色檢測磷酸化Rb（pRb）和Ki67的表達，以確定EILA是否與細胞周期進程和細胞增殖相關。研究者發現，與EILA低表達組相比，EILA高表達組腫瘤中pRb和Ki67的表達水平更高，這表明EILA過表達與細胞周期進展和細胞增殖呈正相關（圖2、H和I）。在單變量和多變量Cox比例風險回歸模型中，較高的EILA表達與Ki67表達顯著相關，但與年齡、腫瘤大小、淋巴結轉移或臨床分期無顯著相關。然而，未發現所分析的因素與細胞周期蛋白E1表達有顯著相關性。為了進一步探索EILA在細胞周期調控中的作用，研究者分析了TCGA-BRCA數據庫中乳腺癌患者的轉錄組數據。根據EILA表達水平將患者分為高表達組（n=554）和低表達組（n=537）?；蚣患治鼋Y果顯示，HALLMARK_E2F_TARGETS基因集和GOBP_MEIOTIC_CELL_CYCLE_PROCESS基因集在高EILA組中比在低EILA組中顯著富集（圖2J）。此外，對與EILA表達最正相關的500個基因進行GO分析顯示，細胞周期通路正調控高度富集（圖2K）?？傊?，這些發現表明EILA是一種預后生物標志物，并與乳腺癌細胞周期進展的正向調節相關。

圖2 EILA提示乳腺癌患者預后不良

4. EILA在體外促進細胞增殖和CDK4/6抑制劑耐藥
       EILA是一種與細胞周期蛋白e1相互作用的lncRNA，在CDK4/6i耐藥中發揮重要作用，與細胞周期進展和不良預后密切相關。在MCF7-palR和T47D-palR細胞中，EILA敲低降低了細胞增殖并恢復了對哌柏西利的敏感性（圖3A，B）。此外，EdU摻入實驗和流式細胞術的細胞周期分析表明，EILA敲低降低了DNA合成并導致G1-S期阻滯，并且在哌柏西利處理后，這種減少程度更大（圖3C，D），衰老相關的β半乳糖苷活性測定表明，EILA敲低誘導了耐藥細胞的衰老，這一過程被哌柏西利進一步增強（圖3E）?？傊?，這些結果表明EILA對CDK4/6i耐藥細胞的耐藥性是必需的。
       此外，研究者通過在MCF-7和T47D親本（MCF7-pa和T47D-pa）細胞中過表達EILA進行了功能獲得分析。結果表明，EILA過表達使其對哌柏西利產生耐藥性（圖3F，G）。此外，在哌柏西利處理存在的情況下，MCF7-pa和T47D-pa細胞中EILA的強表達增加了DNA合成，并促進了G1-S過渡（圖3H，I）。異位表達的EILA還減少了哌柏西利誘導的細胞衰老（圖3J）。綜上所述，這些結果表明EILA能夠促進乳腺癌細胞對CDK4/6i的耐藥性。

圖3 EILA是CDK4/6抑制劑耐藥所必需的

5. EILA的發夾A通過與其c末端結構域相互作用來穩定細胞周期蛋白E1蛋白
       為了探究EILA與細胞周期蛋白E1的相互作用和調控機制，研究者在MCF7-palR和T47D-palR細胞中沉默EILA，并分別用qRT-PCR和蛋白質印跡檢測細胞周期蛋白E1的表達。研究者發現，敲低EILA降低了細胞周期蛋白E1的蛋白水平，但對其mRNA水平影響不大（圖4A，B）。此外，沉默EILA顯著縮短了細胞周期蛋白E1的半衰期（圖4C），表明敲低EILA有助于細胞周期蛋白E1的降解。另一方面，EILA的強表達上調了細胞周期蛋白E1的蛋白水平，延長了其半衰期，但不影響其mRNA水平（圖4D-F）。這些結果表明，EILA通過保護細胞周期蛋白E1免受降解而上調其表達。
       最近的研究表明，特定的lncRNA可能具有明確的二級結構，這些二級結構可能在它們與蛋白質的相互作用中發揮關鍵作用。為了確定與細胞周期蛋白E1相互作用的EILA的核苷酸序列，研究者使用一系列EILA缺失突變進行RNA pull down，然后對產物進行蛋白質印跡。結果顯示，包含核苷酸1~180的EILA突變體與細胞周期蛋白E1蛋白的結合效率與全長EILA相同，而核苷酸1~180缺失的EILA突變體失去了與細胞周期蛋白E1蛋白的結合能力（圖4G，H）。研究者發現，發夾A的強表達增加了細胞周期蛋白E1蛋白表達，延長了其半衰期，而不影響其mRNA水平（圖4I）。這些結果表明，EILA的發夾A是必需的，并負責與細胞周期蛋白E1的相互作用來調節其穩定性。
       為了確定cyclin E1與EILA的精確相互作用域，研究者構建了ha標記的全長和截短的cyclin E1過表達載體。正如RNA pull down的結果所示，只有F2截短突變體可以被生物素標記的EILA下拉，這表明C端是細胞周期蛋白E1與EILA的相互作用區域（圖4J，K）。正如預期的那樣，RIP-qPCR試驗也顯示EILA被F2截短突變體富集（圖4L）。這些結果表明，EILA與細胞周期蛋白E1蛋白在其C末端相互作用。

圖4 EILA的發夾A通過與其c末端結構域相互作用來穩定細胞周期蛋白E1蛋白

6. EILA抑制細胞周期蛋白E1與FBXW7的結合
       眾所周知，cyclin E1的蛋白穩定性受到泛素化介導的蛋白酶體降解的精確控制，cyclin E1的磷酸化位點調節其泛素化。由于EILA與細胞周期蛋白E1的C端相互作用并使其穩定，因此研究者假設EILA可能影響其C端磷酸化位點和泛素化介導的降解。因此，研究者檢測了耐藥細胞和親本細胞中cyclin E1的c末端磷酸化位點。研究者發現，與親本細胞相比，耐藥細胞表達的s384磷酸化的細胞周期蛋白E1水平較低（圖5A）。為了排除CDK2和GSK3β對細胞周期蛋白E1磷酸化的影響，研究者在耐藥細胞和親本細胞中檢測了它們的表達，并發現兩種細胞表達相似的CDK2和GSK3β水平（圖5A）。采用免疫共沉淀和細胞周期蛋白E1特異性抗體泛素化實驗檢測MCF7-pa和MCF7-palR細胞中泛素化細胞周期蛋白E1的水平。與研究者的假設一致，泛素化介導的cyclin E1降解水平在耐藥細胞中降低，而不是在親本細胞中（圖5B）。這些結果表明，耐藥細胞中s384磷酸化cyclin E1的減少可能抑制其泛素化介導的降解。為了確定EILA在調節s384磷酸化的細胞周期蛋白E1和泛素化介導的細胞周期蛋白E1降解中的作用，研究者使用特定的ASO沉默EILA，發現EILA敲低顯著增加了s384磷酸化的細胞周期蛋白E1和泛素化的細胞周期蛋白E1的水平（圖5C，D）。另一方面，EILA過表達降低了磷酸化的細胞周期蛋白E1和泛素化介導的細胞周期蛋白E1降解（圖5E，F）。這些結果表明，EILA調節cyclin E1對S384的磷酸化及其泛素化，從而增加其穩定性。
       為了檢測FBXW7是否在CDK4/6i耐藥細胞中調節細胞周期蛋白E1的穩定性，研究者檢測了細胞周期蛋白E1和FBXW7之間的結合，并發現MCF7-palR細胞中與FBXW7結合的細胞周期蛋白E1少于MCF7-pa細胞（圖5G）。為了確定FBXW7是否在EILA介導的細胞周期蛋白E1穩定性調節中發揮作用，研究者在MCF7-palR細胞中沉默EILA，并通過免疫共沉淀檢測細胞周期蛋白E1與FBXW7的結合。研究者發現，敲低EILA使更多的細胞周期蛋白E1與FBXW7結合（圖5H），這表明EILA阻礙了細胞周期蛋白E1與FBXW7之間的結合。此外，在FBXW7敲低的MCF7-palR細胞中，沉默EILA的表達并不能降低細胞周期蛋白E1的表達，這表明FBXW7參與了EILA介導的細胞周期蛋白E1穩定性的調節（圖5I）。研究者進一步探索了泛素化介導的蛋白酶體降解在EILA介導的細胞周期蛋白E1穩定性調節中的作用，發現在蛋白酶體抑制劑MG-132處理的MCF7-palR細胞中，EILA敲低不能降低細胞周期蛋白E1（圖5J）?？傊?，這些結果表明，EILA通過破壞細胞周期蛋白E1與FBXW7的結合并抑制其泛素化介導的蛋白酶體降解來穩定細胞周期蛋白E1。

圖5 EILA可阻礙細胞周期蛋白E1的泛素化介導的蛋白酶體降解

7. CTCF/CDK8/TFII-I復合物調節EILA的表達
       為了確定調控EILA表達的轉錄因子，研究者對其啟動子區的不同截短突變體進行了熒光素酶報告分析。研究者發現-500~0bp（堿基對）區域對熒光素酶活性至關重要，這表明EILA的轉錄因子可能與該區域結合（圖6A）。接下來，研究者使用JASPAR數據庫預測之前未知的EILA轉錄因子，發現CTCF在結合評分中排名前列（圖6B）。此外，CTCF敲低顯著降低了EILA的表達及其熒光素酶啟動子活性（圖6C，D）。在CTCF轉錄因子的?500到0bp區域有兩個預測的結合位點，分別命名為P1和P2位點。P1位點的突變，而不是P2位點的突變，顯著降低了EILA的熒光素酶啟動子活性，表明P1位點是CTCF的主要結合位點（圖6E，F）。此外，染色質免疫沉淀（ChIP）-PCR實驗也證實了EILA啟動子區域含有CTCF結合位點（圖6G）。這些發現得到了cisstrome數據瀏覽器上的ChIP測序數據的進一步證實，EILA啟動子包含CTCF結合位點（圖6H）。
       CTCF是染色質結構和基因表達的多功能調節因子，包括轉錄激活和抑制。它招募并結合蛋白伴侶來調節基因表達，如TFII-I和CDK8。此外，ChIP-PCR檢測也顯示EILA啟動子區域含有CDK8結合位點（圖6I）。研究者還觀察到，與親本細胞相比，耐藥細胞中TFII-I、CDK8和CTCF的相互作用更強（圖6J），這表明CTCF可能與TFII-I和CDK8協同促進EILA表達。為了探索CDK8和TFII-I在調節EILA表達中的作用，研究者在耐藥細胞中沉默了CDK8和TFII-I，并發現CDK8和TFII-I的敲低顯著降低了EILA的表達（圖6K）。為了確定CDK8和TFII-1是否在CDK4/6i耐藥中發揮作用，研究者評估了CDK8和TFII-1敲低后的哌柏西利敏感性，發現CDK8和TFII-I敲低均恢復了耐藥細胞對CDK4/6i的敏感性（圖6L，M）。這些結果表明，CTCF/CDK8/TFII-I復合物通過與EILA啟動子區結合來調節其表達，并維持對CDK4/6抑制劑的耐藥性。在CDK4/6抑制劑治療后，通過CDK8抑制劑靶向EILA表達可能是一種有前景的策略。

圖6 EILA的表達受CTCF/CDK8/TFII-I復合物的調節

8. EILA促進體內CDK4/6抑制劑耐藥
       為了進一步確定EILA是否在體內促進乳腺癌細胞對CDK4/6i的耐藥性，研究者將MCF7-palR細胞接種到非肥胖糖尿病/重度聯合免疫缺陷小鼠的乳腺脂肪墊中。在腫瘤可觸及后，將其隨機分為6組，分別給予對照溶液、哌柏西利、HLA特異性ASO、對照ASO及其聯合治療。與之前的體外研究結果一致，EILA特異性ASO顯著抑制了腫瘤生長，而哌柏西利和EILA特異性ASO的組合進一步縮小了腫瘤（圖7A，B），表明EILA特異性ASO使耐藥腫瘤對CDK4/6抑制劑重新敏感。此外，哌柏西利和EILA特異性ASO的組合對小鼠體重的影響很?。▓D7C），這表明這些組合是可耐受的。
       EILA特異性ASO顯著降低了EILA的表達和細胞周期蛋白E1的蛋白水平（圖7D，E）。此外，EILA敲低也顯著降低了Ki67和pRb的表達，palbociclib和EILA特異性ASO的組合更大程度地降低了它們的表達（圖7D，E）?？傊?，這些結果表明，用特異性ASO靶向EILA的表達在體內克服了CDK4/6i的耐藥性。

圖7 EILA促進體內CDK4/6抑制劑耐藥

9. EILA可預測對CDK4/6抑制劑的應答，并且在CDK4/6抑制劑進展后上調
       為了進一步證明EILA在CDK4/6i耐藥中的臨床意義，研究者檢測了37例接受CDK4/6抑制劑治療的ER晚期乳腺癌患者中EILA的表達。根據EILA的ISH評分將患者分為高EILA組和低EILA組。Kaplan-Meier曲線分析顯示，EILA高表達預測這些患者的PFS縮短（圖8A）。同樣，cyclin E1蛋白高表達也與這些患者的不良臨床結局相關（圖8B）。此外，在治療前和CDK4/6抑制劑治療進展后，對這些患者進行了7對活檢。對這些配對活檢進行的分析表明，耐藥腫瘤的EILA表達水平高于na?ve腫瘤，細胞周期蛋白E1蛋白上調（圖8C，D）。這些結果表明，EILA表達與CDK4/6抑制劑應答相關，并且在進展后上調，這可能是CDK4/6i耐藥的生物標志物，并可作為克服耐藥的治療靶點。

圖8 EILA預測對CDK4/6i治療反應差，并且在CDK4/6i耐藥的乳腺癌中上調

結論
       綜上所述，該研究表明在E1相互作用的lncRNA EILA中，cyclin-交互lncRNA EILA在調節環蛋白E1穩定性和保持對CDK4/6抑制劑的抗性方面起著重要的作用。EILA是CDK4/6i治療的一個預測生物標志物，也是CDK4/6i進展后的潛在治療目標。

實驗方法
RNA免疫沉淀，RIP測序，lncRNA測序，RNA ISH，IHC，RNA FISH，免疫熒光，RNA scope，蛋白質印跡，免疫共沉淀，泛素化測定，實時熒光定量PCR，染色質免疫沉淀，RNA pull-down，熒光素酶報告基因檢測，小鼠腫瘤異種移植物形成，EILA，菌落形成測定，EdU摻入實驗，細胞周期流式細胞術
參考文獻
Cai Z, Shi Q, Li Y, Jin L, Li S, Wong LL, Wang J, Jiang X, Zhu M, Lin J, Wang Q, Yang W, Liu Y, Zhang J, Gong C, Yao H, Yao Y, Liu Q. LncRNA EILA promotes CDK4/6 inhibitor resistance in breast cancer by stabilizing cyclin E1 protein. Sci Adv. 2023 Oct 6;9(40):eadi3821. doi: 10.1126/sciadv.adi3821.