不孤單的lncRNA Tug1需要PGC1α一起保護腎臟
在涉及線粒體功能障礙的多種潛在機制中，作者發現lncRNA Tug1(牛磺酸上調基因1)的異常表達在促進DN線粒體功能障礙中起核心作用，但其分子基礎尚不清楚。lncRNA Tug1與低表達的足細胞Pgc1α(一種線粒體生物發生的特征明確的主調控因子)之間存在關聯，但其在體內的作用機制尚不清楚，并且缺乏關于PGC1α作為Tug1下游效應體在DN動物模型中的作用的確切證據。本文建立了一個三重突變的糖尿病小鼠模型，并結合代謝組學分析數據來研究Tug1與過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α(PGC1α)的相互作用是否在體內線粒體重構和DN進展中所必需。本文于2021年8月發表在《Cell Reports》IF：9.423期刊上。
技術路線：
主要結果：
為了確定在Tug1轉基因小鼠中觀察到的腎保護特征是否歸因于PGC1α，檢測了Tug1和PGC1α在線粒體重塑和DN進展方面的遺傳相互作用的可能性。如圖1A-1C所示，作者通過小鼠雜交構建了足細胞中PGC1α特異性敲除的小鼠，命名為Pgc1αf/f小鼠。此前，與非誘導糖尿病對照組相比，三苯氧胺誘導的糖尿病Pgc1αPod-f/f小鼠的蛋白尿量或關鍵組織學沒有顯著改變，包括系膜基質擴張和足細胞損失，通過ACR、Wilms腫瘤蛋白1 (WT1)、和PAS染色等測定（圖1D-1G）。與這些發現一致的是，在他莫西芬誘導和非誘導的糖尿病Pgc1αPod-f/f小鼠中，線粒體超微結構檢查顯示了相似的線粒體形態變化，具有相似的長徑比(AR)和形狀因子(FF)值（圖1H-1J）。總之，這些數據表明，在糖尿病環境中，足細胞特異性缺失Pgc1α不會加劇DN的進展或線粒體功能障礙。作者對這些發現的解釋是，由于PGC1α在DN中已經下調，進一步下調其表達不會改變糖尿病腎病的進程或線粒體形態。
圖1足細胞中條件性和誘導性PGC1α的缺失不會加重DN的進展
作者之前已經證明，在幾種糖尿病實驗模型中，足細胞中Tug1的表達降低，糖尿病小鼠足細胞特異性過表達Tug1改善了與DN相關的生化和組織學特征。體外細胞實驗表明在糖尿病環境中PGC1α可以作為Tug1的靶點。因此，接下來作者在體內糖尿病環境中，探討足細胞特異性lncRNA Tug1過表達的腎保護作用是否需要PGC1α。為了驗證這一假設，作者構建了條件誘導性糖尿病db/db模型小鼠：TugPodTg和Pgc1αPod-f/f突變小鼠（圖2A）。三重突變的糖尿病小鼠分三組，如下：db/db/Pgc1αPod-f/f，未誘導糖尿病db/db/TugPodTg/Pgc1αPod-f/f，三苯氧胺誘導糖尿病db/db/ TugPodTg/Pgc1αPod-f/f組。如預期的，對糖尿病TugPodTg小鼠足細胞的qPCR分析顯示，Tug1在不依賴于PGC1α的足細胞中表達顯著增加（圖2B）。觀察到三組患者的體重和血糖變化無統計學意義（圖2C-2D）；然而，足細胞中Tug1過表達導致蛋白尿減少和腎小球系膜基質擴張（圖2E-2H）。Tug1過表達的這些有益作用在三苯氧胺誘導的三重突變的糖尿病小鼠TugPodTg/Pgc1αPod-f/f老鼠中部分逆轉。透射電鏡顯示，Pgc1α敲除可以減輕Tug1過表達對足細胞足突消除和GBM增厚的影響（圖2G-2J）。此外，Tug1過表達小鼠腎小球中足細胞數量的增加在三苯氧胺誘導的糖尿病db/db/ TugPodTg/Pgc1αPod-f/f小鼠中減少約85% （圖2G-2I）。
圖2 在糖尿病db/db模型中，足細胞特異性PGC1α缺失可減輕足細胞特異性lncRNA Tug1轉基因小鼠的腎保護作用
作者接下來探究在體內，Tug1對線粒體穩態的影響是否也由PGC1α介導，主要探究線粒體的4個功能：線粒體生物發生，動力學，氧化還原和生物能。線粒體超微結構顯示，與未誘導糖尿病的小鼠相比，三苯氧胺誘導的糖尿病TugPodTg/Pgc1αPod-f/f小鼠足細胞中線粒體碎片增多，AR和FF顯著下降（圖3A-3D）。鑒于線粒體的形態變化，接下來檢測融合和裂變調節蛋白的表達變化。線粒體融合蛋白包括Drp1，Mff，MiD49和MiD51都顯著下降，但是線粒體融合關鍵組分Mfn1和Mfn2上調在Tug1轉基因小鼠中（圖3E），表明Tug1過表達增強線粒體融合減少片段化；但在誘導的db/db/TugPodTg/Pgc1αPod-f/f小鼠中，Tug1的保護作用在Pgc1α敲除后被消減，提示Pgc1α是Tug1調節線粒體形態所必須的。與此一致，相對于Tug1過表達聯合Pgc1α敲低的糖尿病小鼠的足細胞，Tug1過表達對線粒體生物發生的影響發生了逆轉，如線粒體拷貝數評估，線粒體ROS和總ATP含量（圖3F-3H）。
隨后通過檢測氧耗率(OCR)和細胞外酸化率(ECAR)評估Tug1/Pgc1α軸對線粒體生物能的影響。與對照未誘導db/db/Pgc1αPod-f/f足細胞相比，基礎呼吸和最大OCR在Tug1過表達組都顯著升高；在Tug1過表達的糖尿病小鼠足細胞中沉默Pgc1α可以阻止上述改變（圖3I-3K）。根據ECAR評估，Tug1過表達的足細胞的基礎糖酵解、糖酵解能力和糖酵解儲備比對照非誘導的db/db/Pgc1αPod-f/f足細胞顯著降低，雖然在基礎酸化率和糖酵解儲備方面沒有發現統計學上的顯著差異，但糖酵解能力的下降在Tug1過表達聯合Pgc1α敲低的糖尿病小鼠的足細胞中被逆轉（圖3L-3O）。
總之，這些結果表明Pgc1α是Tug1保護線粒體和減緩DN進展所必須的。
圖3 lncRNA Tug1介導的足細胞線粒體適應被PGC1α敲除反轉
3、尿素循環中間體連接Tug1/PGC1α軸與線粒體重塑
已知細胞在響應外部代謝信號時表現出代謝重塑，其特征是通過在底物和/或代謝途徑之間的轉換來適應代謝需求的變化。為了進一步了解Tug1在關鍵代謝途徑中的作用，作者重新分析了他們之前釋放的足細胞無偏性比較轉錄組數據，該數據分為Tug1-knockdown (shTug1)和scramble short hairpin RNA (shRNA) control (shCtrl) 兩組，該結果為糖酵解、三羧酸循環和氧化磷酸化(OXPHOS)中酶催化反應的一系列mRNA變化提供了一些早期線索（圖4A）。接下來，對全細胞和線粒體代謝物進行代謝組分析。在測定的糖酵解、TCA循環、氨基酸的中間體中，作者發現尿素循環（也被稱為精氨酸-瓜氨酸循環）的中間體在最顯著被改變的，在Tug1-KD和Tug1-KD/Pgc1-OE細胞中（圖4B）。Tug1-KD細胞中，與對照組比，尿素循環的兩種中間產物鳥氨酸和瓜氨酸是上調最顯著的代謝物，與Tug1-KD細胞比較，它們是Tug1-KD/Pgc1-OE足細胞中下調最顯著的代謝物，提示Tug1/PGC1α軸對這兩種關鍵代謝物具有調節作用(圖4C-4D)。代謝產物富集分析也表明嘧啶代謝，尿素循環的下游副產物和精氨酸的生物合成是富集最多的途徑(圖4E和4F)。
為探究Tug1/PGC1α軸如何調節鳥氨酸和瓜氨酸的代謝，評估了尿素循環中的幾個關鍵酶，包括精氨酸琥珀酸合成酶(ASS1)，精氨酸琥珀酸裂解酶(ASL)，精氨酸酶1和精氨酸酶2 (ARG1和ARG2)，以及一氧化氮合成酶(NOS1, NOS2和NOS3)。在Tug1-KD細胞中，ARG2高表達，ASS1、ASL、ARG1和NOS2低表達，而Pgc1-OE逆轉了Tug1-KD對這些酶表達的影響（圖5A-5B）。作者著重關注線粒體ARG2酶，認為增強ARG2表達/活性可能將Tug1/PGC1α軸的一些線粒體效應與鳥氨酸和線粒體代謝物的增加聯系起來。與對照組相比，Tug1-KD組精氨酸酶活性增加，但是Tug1-KD/Pgc1-OE足細胞中回落（圖5C）。在互補實驗中，所得結果與此相反，Tug1過表達導致精氨酸酶活性下降，但是足細胞特異性Pgc1α敲除小鼠廢除了這種效應（圖5D）。在三苯氧胺誘導的db/db/TugPodTg/Pgc1αPod-f/f小鼠足細胞中使用siRNA干擾Arg2基因的表達，結果顯示ATP和生物能與siRNA-NC對照組無差別（圖5E-5F），但是線粒體生物發生，ROS產生和動力學（圖5G-5J）都顯著改變。這提示ARG2部分介導Tug1/PGC1α軸的線粒體效應。
總之，以上結果表明Tug1/PGC1α軸依賴于尿素循環代謝和ARG2活性進而影響足細胞線粒體代謝以適應糖尿病環境。
圖5線粒體Arg2將Tug1/PGC1α軸與線粒體代謝連接起來
總之，本研究證明在體內lncRNA Tug1對足細胞線粒體功能和糖尿病腎病進展的保護作用需要PGC1α。研究發現，改變尿素循環代謝物和線粒體精氨酸酶2 (Arg2)在Tug1/PGC1α誘導的線粒體重塑中發揮重要作用。
圖形摘要
參考文獻：
Li Li., Long Jianyin., Mise Koki., Galvan Daniel L., Overbeek Paul A., Tan Lin., Kumar Shwetha V., Chan Wai Kin., Lorenzi Phillip L., Chang Benny H., Danesh Farhad R.(2021). PGC1α is required for the renoprotective effect of lncRNA Tug1 in vivo and links Tug1 with urea cycle metabolites. Cell Rep, 36(6), 109510. doi:10.1016/j.celrep.2021.109510