雖然目前circRNA在人類癌癥發(fā)展中的功能已有廣泛的研究，但是醫(yī)學(xué)界對其在鼻咽癌（NPC）中作用仍然知之甚少。該文發(fā)現(xiàn)circRNF13通過SUMO2的泛素化可抑制鼻咽癌的增殖和轉(zhuǎn)移。本文于2021年8月發(fā)表在《Molecular Cancer》IF: 27.401期刊上。

技術(shù)路線：

主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

1、CircRNF13在鼻咽癌臨床樣本中低表達(dá)

作者對NPC細(xì)胞進(jìn)行高通量測序獲得cicRNA表達(dá)譜，總計(jì)鑒定到6153個(gè)circRNAs，并包括了5種類型的circRNA（圖1A）。其中豐度較高的circRNF13相對于非腫瘤的鼻炎上皮細(xì)胞（NPE），在NPC中顯著下調(diào)。circRNF13是有外顯子8和外顯子2反向剪切形成，在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均有分布，并且可在RNase R處理下穩(wěn)定存在。以上結(jié)果表明circRNF13可能影響NPC的進(jìn)展。

圖1 CircRNF13在NPC中低表達(dá)

2、CircRNF13抑制NPC細(xì)胞的增殖遷移和侵襲

如圖2所示，在NPC細(xì)胞系HNE2和CNE2中，過表達(dá)circRNF13都會(huì)顯著抑制NPC細(xì)胞的增殖，減少G2/M的細(xì)胞比例，以及侵襲和遷移。但是干擾circRNF13的表達(dá)則有完全相反的結(jié)果。提示circRNF13抑制NPC的生物學(xué)功能。

圖2 CircRNF13抑制NPC的增殖、遷移和侵襲

3、在體內(nèi)circRNF13抑制NPC的生長和轉(zhuǎn)移

如圖3所示，和體外實(shí)驗(yàn)類似，過表達(dá)circRNF13會(huì)抑制NPC的腫瘤生長和肺轉(zhuǎn)移，而干擾circRNF13則逆轉(zhuǎn)這些結(jié)果。表明circRNF13在體內(nèi)也可發(fā)揮抑制NPC生長的作用。

圖3 CircRNF13在體內(nèi)抑制NPC生長和轉(zhuǎn)移

4、CircRNF13可能通過抑制糖酵解抑制NPC的遷移和侵襲

為了探究circRNF13的作用機(jī)制，作者對si-circRNF13細(xì)胞系進(jìn)行了LC-MS/MS檢測，結(jié)果鑒定到294個(gè)差異表達(dá)蛋白，他們的IPA分析結(jié)果顯示主要富集與糖酵解途徑。這些結(jié)果暗示circRNF13可能在NPC中參與調(diào)節(jié)糖酵解途徑。

生化分析結(jié)果顯示，過表達(dá)circRNF13會(huì)抑制NPC細(xì)胞的葡萄糖攝取和乳酸生成（圖4A）。海馬實(shí)驗(yàn)也表明過表達(dá)增加細(xì)胞的糖酵解能力，干擾則相反（圖4B）。通過檢測細(xì)胞內(nèi)AMPK的水平監(jiān)測糖酵解通路。研究表明當(dāng)糖酵解被抑制，細(xì)胞內(nèi)AMPK水平被磷酸化激活，激活的AMPK通過抑制mTOR會(huì)抑制蛋白合成和轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。結(jié)果顯示，過表達(dá)circRNF13顯著增加了NOC細(xì)胞中AMPKα的磷酸化并下調(diào)mTOR水平，并進(jìn)一步下調(diào)下游靶基因mTOR，pS6K和4EBP1的表達(dá)；而敲除circRNF13則有相反的效果（圖4C）。當(dāng)加入糖酵解抑制劑2-DG后，敲除circRNF13不能下調(diào)AMPKα的磷酸化（圖4D）。此外，敲除circRNF13造成的NPC的增殖和遷移會(huì)被2-DG所廢除（圖4E-F）。以上結(jié)果表明circRNF13通過抑制糖酵解抑制NPC的遷移和侵襲。

圖4 CircRNF13抑制NPC細(xì)胞的糖酵解

5、CircRNF13通過促進(jìn)GLUT1的泛素化抑制NPC細(xì)胞的糖酵解

為了探究circRNF13調(diào)控糖酵解機(jī)制，作者檢測了糖酵解通路上的代表性分子GLUT1，LDHA和HK2，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有GLUT1的蛋白水平在過表達(dá)circRNF13后顯著下調(diào)，而mRNA水平?jīng)]有改變（圖5A，B）。于是進(jìn)一步研究GLUT1。作者推測circRNF13可能是通過影響GLUT1蛋白穩(wěn)定性來調(diào)節(jié)糖酵解通路的，因此使用環(huán)己酰亞胺（CHX）處理NPC細(xì)胞在circRNF13過表達(dá)或敲除后。結(jié)果發(fā)現(xiàn)GLUT1的穩(wěn)定性下降，且泛素化水平下降，以響應(yīng)circRNF13的過表達(dá)，而敲除circRNF13后其穩(wěn)定性增強(qiáng)且泛素化增加。因此，以上結(jié)果說明circRNF13可能通過介導(dǎo)GLUT1的降解來調(diào)節(jié)糖酵解通路的。

圖5 CircRNF13通過促進(jìn)GLUT1泛素化抑制NPC細(xì)胞的糖酵解

6、CircRNF13直接結(jié)合SUMO2 mRNA的3’UTR穩(wěn)定SUMO2

為了探究circRNF13調(diào)節(jié)GLUT1泛素化的機(jī)制，作者進(jìn)行了LC-MS/MS，其中SUMO2引起了作者的注意。SUMO2類泛素化修飾（SUMOylation）是泛素化樣蛋白修飾成員可以調(diào)節(jié)蛋白降解通過泛素化途徑。并且研究表明SUMO2在NOC中是抑制糖酵解的。

于是探究circRNF13與SUMO2的結(jié)合關(guān)系。與預(yù)期一致，過表達(dá)circRNF13會(huì)在mRNA和蛋白水平誘導(dǎo)SUMO2的表達(dá)上調(diào)，干擾circRNF13則效果相反（圖6A-B）。生信分析揭示circRNF13和SUMO2的非編碼區(qū)存在結(jié)合位點(diǎn)。RNA pull-down顯示生物素標(biāo)記的circRNF13可以下拉SUMO2的mRNA在NPC細(xì)胞中。上熒光素酶實(shí)驗(yàn)表明過表達(dá)circRNF13會(huì)提高SUMO2的熒光素酶活性。以上數(shù)據(jù)表明circRNF13通過與SUMO2結(jié)合調(diào)節(jié)其表達(dá)。

圖6 CircRNF13直接結(jié)合并穩(wěn)定SUMO2 mRNA，上調(diào)其表達(dá)

7、CircRNF13通過SUMO2促進(jìn)SLUT1的泛素化

接下來探究circRNF13是否是通過SUMO2來促進(jìn)SLUT1的泛素化的。利用anti-Flag-GLUT1抗體進(jìn)行共免疫沉淀(Co-IP)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證GLUT1與SUMO2蛋白之間的相互作用。在SUMOylation期間，UBC9是唯一可以直接識(shí)別底物并催化SUMO蛋白c端羧基與底物蛋白結(jié)合進(jìn)行修飾的連接酶。Co-IP實(shí)驗(yàn)揭示了GLUT1和UBC9之間的相互作用（圖7A-B）。免疫熒光也顯示SUMO2和GLUT1蛋白有共定位。WB顯示過表達(dá)circRNF13促進(jìn)GLUT1的SUMOylation，敲低circRNF13抑制GLUT1的SUMOylation（圖7D）。此外，泛素化實(shí)驗(yàn)表明，過表達(dá)SUMO2可加速GLUT1的泛素化，而當(dāng)共轉(zhuǎn)染si-circRNF13和SUMO2過表達(dá)載體時(shí)，si-circRNF13可減弱SUMO2誘導(dǎo)的GLUT1泛素化水平（圖7E-F）。這些結(jié)果提示，circRNF13通過與SUMO2結(jié)合調(diào)控GLUT1泛素化。總之，circRNF13促進(jìn)GLUT1的泛素化，抑制GLUT1的表達(dá)，從而抑制NPC細(xì)胞的糖酵解過程。

圖7 CircRNF13通過SUMO2促進(jìn)GLUT1的泛素化

8、CircRNF13通過SUMO2抑制NPC的增殖和轉(zhuǎn)移

最后，作者進(jìn)行了拯救實(shí)驗(yàn)，如圖8A-D所示，抑制circRNF13會(huì)促進(jìn)NPC的生物學(xué)功能，包括增殖，遷移和侵襲，但是過表達(dá)SUMO2會(huì)顯著挽救circRNF13敲除帶給NPC細(xì)胞的表型改變。免疫組化顯示，SUMO2在circRNF13過表達(dá)裸鼠腫瘤切片中低表達(dá)，而GLUT1則顯著高表達(dá)。以上證實(shí)circRNF13通過SUMO2抑制NPC的增殖和轉(zhuǎn)移。

圖8 CircRNF13通過SUMO2抑制NPC的增殖和轉(zhuǎn)移

總之，這些結(jié)果強(qiáng)調(diào)了circRNF13在鼻咽癌增殖和轉(zhuǎn)移中的重要意義。CircRNF13作為抑癌因子直接與SUMO2的3 -UTR結(jié)合，延長了SUMO2 mRNA的半衰期。上調(diào)SUMO2通過GLUT1的泛素化來促進(jìn)GLUT1降解，這些通過抑制糖酵解調(diào)控AMPK-mTOR通路，最終導(dǎo)致鼻咽癌的增殖和轉(zhuǎn)移。

參考文獻(xiàn)：

Mo Yongzhen., Wang Yumin., Zhang Shuai., Xiong Fang., Yan Qijia., Jiang Xianjie., Deng Xiangying., Wang Yian., Fan Chunmei., Tang Le., Zhang Shanshan., Gong Zhaojian., Wang Fuyan., Liao Qianjin., Guo Can., Li Yong., Li Xiaoling., Li Guiyuan., Zeng Zhaoyang., Xiong Wei.(2021). Circular RNA circRNF13 inhibits proliferation and metastasis of nasopharyngeal carcinoma via SUMO2. Mol Cancer, 20(1), 112. doi:10.1186/s12943-021-01409-4